纳米抗体制备

纳米抗体服务简介

• 纳米抗体诸多方面均优于传统抗体。基于驼科动物重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代治疗性生物医药与临床诊断试剂中的新兴力量。
  相比于常规抗体，纳米抗体的优势有：
  分子量小，可穿透血脑屏障；原核或真核系统中高表达；特异性强，亲和力高；对人的免疫原性弱等。

M13 噬菌体展示技术

• 噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。
  然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过多轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。

噬菌体文库的构建与纳米抗体的淘选

• 美迪西生物可以提供未经免疫的，足龄（24-36月龄）的骆驼进行抗原免疫，按照标准免疫方法，每个项目免疫4-6针，免疫期间为客户提供ELISA效价测定服务，保证抗血清ELISA效价合格后采血分离PBMC。
  美迪西生物采用M13噬菌体的pIII蛋白进行VHH抗体(纳米抗体)表面展示。我们的科学家构建了带有HA和6*His tag双标签的噬菌粒载体，同时制备出了具有10⁸转染效率的TG1宿主菌感受态，经过2-3次转染与扩增，能够为客户提供有效库容量大于10⁸的高质量VHH抗体展示文库。经过几轮纳米抗体文库淘筛，即可获得至少20株具有高亲和力的噬菌体株。

骆驼与羊驼VHH抗体文库对比

• 比较项目	骆驼VHH抗体文库	羊驼VHH抗体文库
  抗原耐受量	高，可多种抗原混合高剂量免疫	较高，多种抗原混合中等免疫剂量
  HCAb血清中球蛋白比列	60%~80%	20%~30%
  中和抗体效价	高	较高
  采血量	一次可采血200ml	一次80-100ml血液
  有效库容	高，免疫库108-109	高，免疫库107-108
  动物成本	较低	高
  抗原需求量	4-6mg，纯度>85%	4-5mg，纯度>85%

纳米抗体制备服务流程示意图

• 

  Image source: MA Lin-lin, et al. Construction and screening of phage display library for TIM-3 nanobody. Acta Pharmaceutica Sinica2018, 53 (3): 388-395.

驼科纳米抗体文库制备项目流程

• 步骤	内容	周期	交付
  第一步：抗原准备	客户提供抗原或者美迪西准备抗原	3-4周	如果客户提供抗原，质量标准：1. >5mg；2. SDS-PAGE >95%
  第二步：动物免疫	免疫未免疫的空白骆驼 5 ml 未免疫血清 ELISA检验血清效价	10-12周	如果由于抗原毒性导致的动物死亡,需要收取一定费用 根据 ELISA结果，客户决定如何建库
  第三步：抗体cDNA制备	外周血分离PBMC 提取总RNA并反转录为cDNA	3-4周	提供存放在Trizol 中的PBMC 提供高保真RT-PCR制备的cDNA
  第四步：噬菌体文库构建	构建噬菌粒 噬菌体文库构建		VHH片段插入率≥75% 有效库容量≥108CFU/mL
  第五步：噬菌体文库淘选	噬菌体展示纳米抗体，淘选，至少淘选两轮 阳性克隆的ELISA验证、鉴定、筛选和测序（200个克隆测序） 阳性克隆测序及测序结果分析	4-6周	保证至少 20 个序列

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