靶向不可成药靶点KRAS[1]
KRAS简介- RAS是GTPase原癌基因家族成员，包括三个密切相关的RAS亚型：HRAS、KRAS和NRAS。在所有RAS亚型中，KRAS突变频率最高，其次是NRAS和HRAS。KRAS突变在胰腺癌、肺癌和结直肠癌中尤为常见。在癌症中最常发生突变的残基是G12、G13和Q61。KRAS蛋白存在两种剪接变体KRAS4A和KRAS4B，其中KRAS4B在人类细胞中占主导地位。KRAS(Kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homolog，Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物)基因是编码GTP/GDP结合蛋白的原癌基因，属于GTPase RAS家族。KRAS蛋白作为分子开关，在GDP结合的无活性状态和GTP结合的活性状态之间循环。KRAS蛋白分别通过与GTP和GDP结合，在无活性形式和活性形式之间转换。虽然KRAS蛋白具有内在的核苷酸交换和GTP水解，但其细胞信号传导状态是由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)激活引起的，如催化GTP结合的SOS(son of sevenless)和Ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白，以及GTPase激活蛋白(GAPs)催化的去激活作用，如刺激GTP水解的p120GAP和神经纤维蛋白(NF1)。
KRAS GTPase循环[1]
KRAS结构- KRAS蛋白包含四个结构域。在三种RAS亚型中，N端的第一个结构域是相同的，第二个结构域的序列相似性相对较低。这两个区域对KRAS蛋白的信号功能都很重要，并共同形成了G-结构域。KRAS蛋白分子量为21 kDa，由6条β-折叠链(形成蛋白核心)和5条α螺旋结构组成，形成两个主要结构域：G结构域和C端结构域。KRAS的G结构域由残基1-166组成，包括GTP结合口袋，该区域对于下游效应物和GTPase激活蛋白(GAPs)之间的相互作用至关重要。G结构域是高度保守的，包含负责GDP-GTP交换的switch I和switch II区域。C端是一个包含CAAX (C=半胱氨酸，A=任意脂肪氨基酸，X=任意氨基酸)基序的高变区，引导翻译后修饰并决定细胞膜锚定。该区域在RAS蛋白的生物活性调控中起着重要作用。
KRAS的晶体结构[2]
KRAS二级结构的二维示意图[2]
KRAS信号通路- KRAS是激活一系列信号分子的上游信号传感器之一，能够转导信号从细胞表面传递到细胞核，并调控一系列基本的细胞过程，如细胞分化、生长、趋化和凋亡。除了上述GTP/GDP结合外，KRAS信号的激活现在被认为是一个多步骤的过程，需要适当的KRAS翻译后修饰、细胞膜定位和与效应蛋白的相互作用。KRAS蛋白的信号转导并不只发生在细胞膜上。KRAS对下游信号通路的激活也可以由亚细胞区域(如内质网和高尔基体)的信号触发。在细胞外刺激作用下，从失活的RAS-GDP到激活的RAS-GTP的转化进一步促进了多种信号通路的激活，包括MAPK通路、PI3K通路和Ral-GEFs通路，其中以MAPK通路的特征最为明显。已知RAS-GTP直接与RAF蛋白结合，将RAF激酶家族从细胞质招募到膜上，在细胞膜上二聚化并活化。激活的RAF随后对其下游底物，即MEK和ERK进行一系列磷酸化反应，并传导生长信号。
主要的KRAS效应通路[1]
KRAS蛋白的结晶研究- 高通量结晶筛选1000+筛选条件
- 上海同步辐射光源 (Shanghai Synchrotron Radiation Facility; SSRF)美迪西参与了上海光源的设计、建设和管理，这是一个用于大分子晶体学的工业光束线站，大分子光束线于2009年7月开通。
工业用大分子晶体学线站卓越的光束线和服务 更低的成本 3.5 GeV存储环 全年运营紧邻张江高科技园区和浦东机场 - 研究案例KRAS-G12D
KRASG12D的筛选
KRASG12D的X射线衍射数据KRAS-G12D with MRTX1133
共晶的筛选
共晶的X射线衍射数据KRAS-G12D
KRASG12D与7RPZ的结构比较，绿色为PDB ID 7RPZ，粉色为美迪西的数据。这些数据关联性非常强。KRAS-G12D with MRTX1133
KRASG12D与MRTX1133的共结晶结构(7RPZ, PDB)比较，绿色结构为PDB ID 7RPZ，青色为美迪西的数据。这些数据关联性非常强。KRAS-G12D with MRTX1133
与GDP结合的KRASG12D与MRTX1133的共晶结构
KRAS靶向药物的体外研究- 在研究和开发的初始阶段，体外功能分析对候选KRAS靶向药物的实际评估至关重要。这些分析为验证KRAS靶向药物活性提供了科学依据，并提供了支持治疗效果的初步证据。因此，它们在KRAS靶向候选药物选择的决策过程中起着关键作用。KRAS细胞试验美迪西已经验证了KRAS突变细胞系的细胞毒性测试方法，2D和3D试验均可用于KRAS抑制剂的评估。
通过CellTiter-Glo检测2D细胞增殖试验
- 细胞毒性试验(3D)NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity Assay (3D)
以1 μM起始浓度、按1:3连续稀释的药物处理NCl-H358细胞288 h后，显微镜检测细胞毒性结果。
- NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity CTG Assay (2D; 3 days)
以1 μM起始浓度、1:3连续稀释的药物处理NCI-H358细胞72 h后，CTG测定细胞毒性。
- NCI-H358 (Lung, KRASG12C) Cell Cytotoxity CTG Assay (3D;12 days)
以1 μM起始浓度、1:3连续稀释的药物处理NCI-H358细胞288 h后，显微镜测定细胞毒性。
- 基于蛋白的生化活性试验
Kras G12C-SOS1结合的IC50活性测试筛选试验化合物
- 鸟嘌呤核苷酸交换试验
KRAS在含有1mM BODIPY FL-GDP, 20 mM HEPES pH 7.6, 10 mM EDTA, 20 mM硫酸铵和1 mM DTT的溶液中，在4°C下孵育48小时。用20 mM MgCl2溶液停止反应。将含有KRAS蛋白的BODIPY-FL-GDP浓缩去除BODIPY-FL-GDP。图A：试验方法的MoA
KRAS靶向药物的药理药效学研究- KRAS突变-CDX模型
Cancer Type Cell Lines KRAS G12C MIA PaCa-2, NCI-H358, UM-UC-3, Calu-1 KRAS G12D GP2D, SW1990, AsPC-1 KRAS G12V SW480, CAPAN-1, NCI-H727 KRAS G13D LoVo, HCT-116, HT15 Medicilon Case: CDX - KRAS Mutation (G12C)
PDX重要突变/过表达/耐药模型GENE PDX ID KRAS Mutation PDXM-060C (p.G12V), PDXM-069C (p.G12V),PDXM-075C (p.G12D), PDXM-076C (p.G13D),PDXM-212Li (p.G12D) TP53 Mutation PDXM-060C (p.R273H), PDXM-072C(p.Y234H) PIK3CA Mutation PDXM-075C (p.H1047L), PDXM-092Ga (p.E545G) BCR-ABL Fusion PDXM-242Le ERBB2 Overexpression PDXM-069C, PDXM-016C, PDXM-060C, PDXM-087C, PDXM-104C… ... ... Resistance* PDX ID Docetaxel + Cisplatin PDXM-271O (Ovarian cancer) VDLP + MA + CVAD PDXM-293Le (Leukemia) Radiation PDXM-311(H&N) ... ... * note: these resistance models are not related to KRAS mutation
- Medicilon Case: PDX -- KRAS Mutation (G12D)
Medicilon Case: AMG-510 Resistant Model - Calu-1 (G12C)
野生型肺癌模型
耐药肺癌模型(通过体内治疗2个周期(P2)建立，每个周期2个月。这里展示的是P3结果。
KRAS靶向药物的药代动力学研究- 美迪西为KRAS靶向药物PK研究的关键参数提供高质量的定量分析，结果准确。美迪西案例：KRAS-PDEδ抑制剂的药代动力学KRAS-PDEδ蛋白-蛋白相互作用是癌症治疗的一个极具吸引力的靶点。设计并合成了一系列高效的PROTAC PDEδ降解剂。最有潜力的Compound 17f是治疗KRAS突变型结直肠癌的PROTAC PDEδ降解剂。Compound 17f为KRAS-PDEδ相互作用的可成药性研究提供了新的化学工具或先导化合物。Compound 17f在SW480结直肠癌异种移植模型中具有显著的抑制肿瘤生长作用。这项验证研究为靶向KRAS-PDEδ相互作用的可成药性提供了新的策略，并为治疗KRAS突变型癌症提供了有效的先导化合物。
PROTAC策略和KRAS-PDEδ抑制剂Compound 17f[3]
- 采用Sprague-Dawley (SD)大鼠进行Compound 17f的药代动力学研究。在剂量为50 mg/kg下腹腔注射给药后，分析Compound 17f在血浆中的浓度。这些试验由美迪西进行。Compound 17f的半衰期约为5.1 h，峰值浓度Cmax为564 ng/mL。虽然Compound 17f的分子量较大(MW=723)，但能在大鼠体内有效吸收并达到足够的血浆暴露量，其曲线下面积(AUC)值为4710 h·ng/mL。
Compound 17f在大鼠体内的PK参数[3]
美迪西助力KRAS项目举例- 2022年5月，NMPA批准了信诺维抗肿瘤1类新药XNW14010的临床申请，拟用于治疗伴有KRAS G12C突变的晚期实体瘤。XNW14010是一种高选择性的小分子KRASG12C蛋白共价结合抑制剂。临床前实验数据显示XNW14010在不同的肿瘤模型中均有良好的抗肿瘤活性，且呈现良好的量效关系，并具有良好的经口给药药代动力学特征和较为理想的安全窗口。美迪西作为信诺维的合作伙伴，为XNW14010的研发提供了（包括药代和安全性评价在内）综合性临床前研究服务，为项目获批临床提供了有力支撑。
- 劲方医药科技（上海）有限公司研发的氟泽雷塞，是一款高效口服KRAS G12C小分子抑制剂，通过共价不可逆修饰KRAS G12C蛋白突变体半胱氨酸残基，抑制该蛋白介导的GTP/GDP交换从而下调KRAS蛋白活化水平。依托成熟的药代动力学研究平台，美迪西为氟泽雷塞提供了早期阶段的动物实验药物代谢动力学服务，助力氟泽雷塞的早期开发。
- 参考文献：
[1] Pingyu Liu, et al. Targeting the untargetable KRAS in cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 2019 Sep;9(5):871-879. doi: 10.1016/j.apsb.2019.03.002.
[2] Tatu Pantsar. The current understanding of KRAS protein structure and dynamics. Comput Struct Biotechnol J. 2019 Dec 26:18:189-198. doi: 10.1016/j.csbj.2019.12.004.
[3]Junfei Cheng, et al. Discovery of Novel PDEδ Degraders for the Treatment of KRAS Mutant Colorectal Cancer. J Med Chem. 2020 Jul 23;63 (14):7892-7905. doi: 10.1021/acs.jmedchem.0c00929.
[4]Gongmin Zhu, et al. Role of oncogenic KRAS in the prognosis, diagnosis and treatment of colorectal cancer. Mol Cancer. 2021 Nov 6;20(1):143. doi: 10.1186/s12943-021-01441-4.
[5]Tamas Yelland, et al. Stabilization of the RAS:PDE6D Complex Is a Novel Strategy to Inhibit RAS Signaling. J Med Chem. 2022 Feb 10;65 (3):1898-1914. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c01265.
[6]Timothy H Tran, et al. KRAS interaction with RAF1 RAS-binding domain and cysteine-rich domain provides insights into RAS-mediated RAF activa-tion. Nat Commun. 2021 Feb 19;12(1):1176. doi: 10.1038/s41467-021-21422-x.
