美研|CMC系列(十四)：离子色谱的使用原理及其在药物研发中的应用

摘要

现代离子色谱（Ion Chromatography）技术起源于上世纪70年代，它的开始源于H.Small及其合作者的工作。离子色谱是高效液相的一种，是分析阴、阳离子、小分子极性有机物（酸碱）等的一种液相色谱。离子色谱在药物分析中的应用补充了液相色谱和气相色谱对离子型药物分析的不足，可用做离子化合物及其杂质的定性与定量研究，已成为药物质量研究与质量控制的手段之一。

在实际的方法开发与应用中离子色谱可以连接多种类型的检测器，例如电导检测器、电荷检测器、安培检测器和光学检测器等^[1]。其具有灵敏、快速、准确度高和选择多样性的有点，逐渐获得了很多研究人员和技术人员的青睐，其被广泛应用到环境、食品、饮料、工业、医疗卫生、药物研发、化工、电子、生命科学和农业等领域。

关键词：离子色谱；药物质量研究；定性与定量分析

在药物研究的过程中，离子色谱常用作对离子型化合物的分析和定量研究。离子化合物，是由阴离子（Anion，带负电）和阳离子（Cation，带正电）组成，其本质上是库仑力的离子键相结合的化合物。离子化合物通常熔点和沸点较高，熔融时或电离产生其组成离子的水溶液中时能导电。大部分离子化合物在常温下是固体。

对于适用于离子色谱检测的常见类型阳离子，主要包括第一主族和第二主族的碱金属和碱土金属和部分的过度金属元素，活泼金属离子（如锂钠离子、钾离子、钙离子、镁离子等）；常见类型阴离子，主要包括卤素离子、有机和无机酸根离子（如氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、甲酸根、三氟乙酸根、硝酸根和硫酸根等），其在水溶液条件下可导电，其常用电导检测器原理为可连续检测流出物的电导变化。

01 离子色谱的基本组成

01 进样系统

进样器是是将样品送入色谱柱的装置，是离子色谱仪进行化合物分析的重要组成部分。自动进样器包括进样臂、进样针、样品盘、清洗系统、驱动系统以及控制系统等部分组成，各个部分之间紧密合作，共同带动着自动进样器的正常运行。特别说明进样针为PEEK材质，具有耐腐蚀等优点，但材质较为脆弱，样品瓶盖需使用预开口盖。

02 泵模块

输液泵为离子色谱仪提供动力，是液相的核心部件。根据泵的工作原理又可以分为串联式双柱塞往复泵、并联式双柱塞往复泵和单柱塞往复泵，材质为耐压耐腐蚀的PEEK材料（色谱柱正常使用压力一般小于20MPa），具有输出压力高、耐腐蚀、流量稳定、噪音低等优点。

03 淋洗液发生系统

生成淋洗液（流动相）的关键模块，区别于液相色谱的专有模块，常用阴离子检测发生罐为氢氧化钾淋洗液发声罐；常用阳离子检测发生罐为甲基磺酸淋洗液发生罐，为电解池原理，通过控制电流大小而得到相应浓度的淋洗液系统。优点是所得淋洗液洁净度高、对背景影响小、浓度准确、无需人为配制淋洗液。

04 抑制系统

抑制系统是离子色谱的核心部件之一，主要作用是降低背景电导和提高检测灵敏度。抑制器的好坏关系到离子色谱的基线稳定性、重现性和灵敏度等关键指标。

① 柱－胶抑制：采用固定短柱或现场填充抑制胶进行抑制，不同的抑制柱交替使用，属于间歇式抑制。
② 离子交换膜抑制：采用离子交换膜，利用离子浓度渗透的原理进行抑制。需要配制硫酸再生液，系统需要配置氮气或动力装置。
③ 电解自再生膜抑制：利用电解水产生媒介离子和离子配合离子交换膜进行抑制（最佳选择）。

05 分离及检测系统

分离系统是色谱体系的重要模块，其使用色谱柱常包括两部分组成。

① 保护柱：保护柱与分析柱填料相同，消除样品中可能损坏分析住填料的杂质。如果不一致，会导致死体积增大、峰扩散和分离度差等。
② 分析柱：分离样品组分。离子色谱常用分离模式有三种，分别是离子交换色谱、离子排斥色谱和离子对色谱[2]。

检测系统由抑制器和检测器两部分组成，抑制器的主要作用是通过电解抑制或化学抑制的方式降低检测背景值，提高待测离子的响应：

① 检测器主要为电导检测器，是通过测定溶液流过电导池电极时的电导率，电导率越大，电阻率越小，电阻率与电阻成正比，电阻越小电流值越大，电导检测器是基于极限摩尔电导率应用的检测器，主要用于检测无机阴阳离子、有机酸和有机胺等；
② 另一种检测器为安培检测器，安培检测器是基于测量电解电流大小为基础的检测器，主要用于检测具有氧化还原特性的物质，安培检测器分为主适用于抗坏血酸、溴、碘、氰、酚、硫化物、亚硫酸盐、儿茶酚胺、芳香族硝基化合物、芳香胺、尿酸和对二苯酚等物质的检测的直流安培检测器、适用于醇类、醛类、糖类、胺类（一二三元胺，包括氨基酸）、有机硫、硫醇、硫醚和硫脲等物质的检测用于醇类、醛类、糖类、胺类（一二三元胺，包括氨基酸）、有机硫、硫醇、硫醚和硫脲等物质的检测的脉冲安培检测器以及在脉冲安培检测器基础上升级的积分安培检测器。

06 离子色谱仪的管道系统

管道材料有PEEK管（高压区）、PTFE管、硅胶管（气路或废液用）、各种接头和连接配件。

02 离子色谱仪的工作流程

高压输液泵将流动相以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器。

抑制型离子色谱则在电导检测器之前增加一个抑制系统，即用另一个高压输液泵将再生液输送到抑制器。在抑制器中，流动相背景电导被降低，然后将流动出物导入电导池，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理或保存。

03 离子色谱的基本流路

04 离子色谱电解抑制器的抑制原理

在离子色谱的抑制法分析过程中，使用的淋洗液是强电解质，在不使用抑制器的情况下，背景电导高，灵敏度差。

以阴离子分析为例，阴离子抑制器的作用是将高电导的淋洗液转变成为低电导的弱酸或水，从而提高检测的灵敏度。比如常用的淋洗液是Na2CO3-NaHCO3混合溶液和KOH，都是强电解质，其电导比较高，而电导检测器是一种通用性检测器，选择性相对较差，对进入电导池的导电物质都有电导响应，就是说淋洗液和待测离子都有电导响应，这样在高的淋洗液背景电导下待测离子的电导信号就相对小了。如果要提高检测灵敏度，就需要将淋洗液转变为低电导的物质，抑制器就是来完成这个任务的，将其连接在柱与电导池之间，在样品经色谱柱分离后，将淋洗液和待测离子转变为相应的酸，比如：Na2CO3-NaHCO3转变为碳酸；KOH转变为水；Cl-、SO42-转变为盐酸、硫酸。

这样下来，淋洗液变成了弱酸，使得背景电导大幅降低。而待测离子的阳离子被转换成了H+，H+的极限摩尔电导是350μS，比Na+、K+等阳离子的极限摩尔电导高他们分别是50μS和74μS。检测器检测的是阴阳离子的电导之和，这样转化成的HCl比原来样品中的NaCl、KCl电导响应提高了。从而提高了检测灵敏度。总结一下就是，经过阴离子抑制器后背景电导大幅下降而待测离子的响应电导上升，从而提高了检测灵敏度。

05 离子色谱常见问题及解决办法

01 背景抬高

① 淋洗液用超纯水污染。解决办法：更换淋洗液用超纯水，去离子水电导率一般为18.2兆欧姆；
② 方法参数设置不当。解决办法：检查实验方法，淋洗液选择对应用淋洗液，抑制器电流设定应与所用淋洗液浓度匹配；
③ 抑制器故障。解决办法：检查抑制器循环水出口是否有连续的气泡产生，抑制器有无漏液等情况，若无连续气泡产生或由漏液情况，则应及时更换抑制器。

02 分析泵常见故障

基线的噪声加大，色谱峰形变差。解决办法：通常为泵内产生气泡或漏液，尝试手动排气泡操作。

03 抑制器常见故障

抑制器在离子色谱仪中具有举足轻重的作用。抑制器工作性能的好坏对分析结果有很大的影响。抑制器最常见的故障是漏液，使峰面积减小（灵敏度下降）和背景电导升高。

① 峰面积减小
造成峰面积减小的主要原因有：微膜脱水、抑制器漏液、溶液流路不畅和微膜被玷污。抑制器长期不用，会发生微膜脱水现象，为激活抑制器，可用注射器向阴离子抑制器内以淋洗液流路相反的方向注入少许0.2mol/L的硫酸溶液。同时向再生液进口注入少许纯净水，并将抑制器放置半小时以上。抑制器内玷污的金属离子可以用草酸钠清洗。

② 漏液
抑制器漏液的主要原因是抑制器内的微膜没有充分水化。因此，长时间未使用的抑制器在使用前应让微膜水溶胀后再使用。另外要保证再生液出口顺畅，因此反压较大时也会造成抑制器漏液。另外抑制器保管不当造成抑制器内的微膜收缩、破裂也会发生漏液现象。

③ 背景电导值高
在化学抑制型电导检测分析过程中，若背景电导高，说明抑制器部分存在一定的问题。大多数是操作不当引起的。例如淋洗液或再生液流路堵塞，系统中无溶液流动造成背景电导偏高或使用的电抑制器电流设置的太小等。膜被污染后交换容量下降亦会使背景电导升高。而失效的抑制器在使用时会出现背景电导持续升高的现象，此时应更换一支新的抑制器。

06 案例分享

案例一 某多肽药物中有机胺吡啶残留的测定（阳离子模式）

在多肽药物的合成中，常用FOMC作为氨基保护基团，而脱去FOMC常用哌啶、DMF脱去，而哌啶作为残留溶剂需在中间过程或终产品中进行质量控制，哌啶是纯粹碳链供电子共轭,因此其碱性较强，常规的GC检测方法峰型较差，易产生残留和拖尾等问题。

阳离子模式下检测哌啶分析方法

阳离子模式下检测哌啶（系统适用性）

系统适用性6针重现性良好，保留时间RSD为0.1%，峰面积RSD为2.3%，不对称因子1.1，连续进样系统无哌啶残留。满足验证RSD要求。

阳离子模式下检测哌啶（线性）

0.2032μg/ml~2.0320μg/ml线性范围良好，线性相关系数r值0.9999，加标回收率98.9%~101.1%之间。

案例二 葡萄糖中葡糖酸含量测定，限度0.1%（阴离子模式）

葡萄糖上的醛基进一步氧化为羧基即生成葡糖酸，其特点为易溶于水、几乎无紫外吸收、极性大、沸点高等，常规的HPLC、GC等检测方式无法满足低限度的分析检测。

阴离子模式下检测哌啶分析方法

阴离子模式下检测葡糖酸（系统适用性）

系统适用性6针重现性良好，保留时间RSD为0.3%，峰面积RSD为0.9%，不对称因子1.0，连续进样系统无葡糖酸残留。

阴离子模式下检测葡糖酸（线性）

2.6062μg/ml~15.6369μg/ml线性范围良好，线性相关系数r值0.9993，加标回收率91.6%~95.6%之间。

案例三 某API为盐酸盐化合物（阴离子模式盐酸盐含量测定）

某IND申报药物，API为盐酸盐化合物，水溶性较差，溶液颜色复杂，经研究成盐比会影响其晶型，氯离子含量需严格控制在8.7%~9.3%之间。

盐酸盐含量检测（系统适用性）

通过离子色谱法测定氯离子含量，方法具有极其优秀的重现性，可通过样品的前处理方式处理化合物溶解性较差等问题，溶液具有颜色等问题对离子色谱法检测无影响。

盐酸盐含量检测（线性）

5.0000μg/ml~15.0000μg/ml线性范围良好，线性相关系数r值0.9999，含量回收率99.5%~901.0%之间。

参考文献：

[1]牟世芬.朱岩.刘克纳.离子色谱法及其应用.北京: 化学工业出版社，2018.3.
[2] 傅若农.色谱分析概论M.北京: 化学工业出版社，2005.3.

美研|CMC系列回顾

❖ CMC系列(一)|浅谈药物研发中原料药工艺研究的重要性

❖ CMC系列(二)|药学研究之世界银屑病日

❖ CMC系列(三)|高端吸入药物的市场格局和研究现状

❖ CMC系列(四)|浅谈手性药物的研究策略

❖ CMC系列(五)|药物晶型控制策略

❖ CMC系列(六)|含氮类化合物-可挥发碱性有机胺的气相分析

❖ CMC系列(七)|新药研究中的固态开发挑战及应对策略

❖ CMC系列(八)|浅析ICH指导原则Q3C及未收录残留溶剂限度制定方法

❖ CMC系列(九)|定量核磁应用及其方法验证/定量核磁那些事儿

❖ CMC系列(十)|药物杂质研究策略之基因毒性杂质

❖ CMC系列(十一)|手性化合物的拆分策略与经验分享

❖ CMC系列(十二)|单晶结构解析在药物开发中的应用和单晶培养哪些事儿

❖ CMC系列(十三)|X射线粉末衍射法在药物晶型定性分析中的应用