据2018年国际癌症研究机构(IARC)调查数据显示，乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2%，占据女性癌症的首位，其中52.9%发生在发展中国家。从发病年龄来看，乳腺癌发病率从20岁以后开始逐渐上升，45~50岁达到峰值。
三阴性乳腺癌（TNBC）是所有乳腺癌中的一种，因雌激素受体、孕激素受体和HER-2三个主要治疗靶点均为阴性而被称为“三阴”，约占所有乳腺癌的15%左右。这种乳腺癌由于缺乏靶点、复发转移风险高，而被认为是“最毒、最凶险”的乳腺癌。其中，因经历过多轮治疗后病情仍然进展的三阴性乳腺癌更是接近“山穷水尽”，经常规方案治疗后肿瘤缩小的患者比例不到10%。
自然界充满了对我们有害的化合物，但是医学科学家们一直向我们展示如何利用它们来造福人类甚至变成可以救命的药物。近日，澳大利亚科学家的一项突破性发现就是最新的例子，该团队展示了蜜蜂毒液中的一种成分如何可以用作抗乳腺癌的“极强效”武器。这项研究是在澳大利亚哈里·珀金斯医学研究所进行的，之前我们已经看到过蜂毒中的某些肽和蛋白质如何用于跨血脑屏障运送药物，但Duffy博士的研究重点在于如何将其用于治疗各种乳腺癌。她的研究重点是蜜蜂毒液中一种称为蜂毒肽的活性化合物，以及它如何在不同临床亚型的乳腺癌中诱导细胞死亡。该研究发表在《自然精密肿瘤学》杂志上。
蜜蜂毒液和蜂毒肽可特异性降低乳腺癌细胞的生存能力
来源：npj Precision Oncology
为了评估抗癌功效和选择性，研究人员评估了从澳大利亚收集的蜜蜂毒液，毒液显示出很高的抗癌选择性，在TNBC和富含HER2的乳腺癌细胞系中具有更高的效力，其次是腔内乳腺癌细胞，对正常细胞的影响最小。
研究人员开发了一种识别蜂毒素的小鼠单克隆抗体，以通过ELISA评估所有蜜蜂和大黄蜂毒液样品中蜂毒素的相对丰度。根据上述活性研究，蜂毒素的相对丰度在不同位置的所有蜜蜂毒液样品中均无显着差异（双向方差分析，p>0.999）。但是，与大黄蜂毒液和同种型IgG对照相比，蜜蜂样品中蜂毒肽的浓度明显更高。
蜂毒肽的抗癌作用通过体外阻断实验得以证实，在该实验中研究人员利用抗蜂毒肽抗体拯救了HDFa和SUM159细胞的细胞活力。这些数据表明，蜜蜂毒液中存在的蜂毒肽是所研究的毒液中最突出的生物活性抗癌化合物。
蜜蜂毒液和蜂毒肽可诱导乳腺癌细胞死亡
为了查明细胞死亡的机制，用蜜蜂毒液或蜂毒肽的IC50分别处理TNBC细胞18和24小时，并通过裂解的caspase-3分析处理以量化凋亡细胞的死亡。免疫印迹证实了在SUM159细胞中裂解的caspase-3的诱导，单独的蜂毒肽在治疗后18和24h均比蜜蜂毒液能诱导更高的癌细胞凋亡水平。
来源：npj Precision Oncology
为了量化治疗后的凋亡、坏死或死亡细胞群体，研究人员进行了膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测分析。使用IC50浓度将SUM159细胞暴露于媒介物、蜜蜂毒液或蜂毒素，并在60分钟处理后通过流式细胞仪处理。研究人员发现与蜜蜂毒液（8.3±1.9％）和媒介物对照（4.8±0.4％）相比，经蜂毒素处理的样品（23.6±5.7％）的晚期凋亡或坏死细胞明显增多（23.6±5.7％），然而早期凋亡或坏死细胞水平均无显著差异。为了表征较短时间内细胞死亡的动力学，测量了用IC50浓度的蜂毒肽处理长达1小时的HDFa、SKBR3和SUM159细胞的细胞活力。蜜蜂毒液会迅速降低细胞活力，正常细胞和癌细胞系在一小时内没有显著差异。相反，从10分钟起，蜂毒肽与正常细胞相比显著降低了两种乳腺癌细胞的活力，从30分钟起，SUM159显着高于SKBR3（双向ANOVA，p < 0.0001）。SKBR3和SUM159细胞中的活细胞共聚焦显微镜检查和扫描电子显微镜检查说明，用蜂毒和蜂毒肽处理相对于媒介物处理在10至60分钟内质膜会迅速破裂和收缩。
蜜蜂毒液和蜂毒肽抑制RTK磷酸化
来源：npj Precision Oncology
在SUM159中，蜜蜂毒液和蜂毒素在10到20分钟内显著下调了p-EGFR，在MAPK和Akt途径SUM159细胞由于负调节反馈回路触发ERK信号，以保护细胞免于凋亡细胞死亡的释放。抗蜂毒毒素抗体表明，随着时间的推移，两种细胞系的裂解物中蜂毒素的含量均增加，与蜜蜂毒液相比两种细胞系中蜂毒素处理的信号更强。为了表征另一种TNBC模型中对信号通路的影响，研究人员对MDA-MB-231细胞进行了免疫印迹分析，其中EGF处理使EGFR磷酸化并诱导EGFR表达。与SUM159细胞不同，EGF对EGFR的刺激与p-Akt磷酸化的增加并不相关，这可能是由于EGFR信号传导与Akt途径之间的分离所致。
考虑到富含TNBC和HER2的乳腺癌细胞高度依赖EGFR和HER2的激活，研究人员进行了生物发光共振能量转移（BRET）实验，以确定蜂毒肽是否干扰EGF与EGFR的结合。TAMRA-EGF和FITC-DEDE-melittin的BRET信号呈剂量依赖性增加，而FITC-melittin的幅度较小。在相同浓度下，FITC-DEDE-melittin的BRET比比FITC-melittin高得多，并且在每个剂量下均能很快达到最大BRET比。为了确定蜂毒肽在EGF结合位点与EGFR结合的特异性进行了饱和BRET分析以评估EGF与每种结合NanoLuc-EGFR的肽的竞争。当存在1 µM EGF时，TAMRA-EGF与NanoLuc-EGFR的结合达到饱和并显着降低，而FITC蜂毒蛋白和FITC-DEDE-melittin的BRET信号不饱和，并且在有或没有1 µM EGF的情况下均无显着差异，这表明蜂毒肽和DEDE-melittin均未结合在EGF结合位点。
总之蜂毒肽通过存在于C端的带电序列整合到癌细胞的质膜中，从而诱导质膜重塑和破坏。BRET数据表明蜂毒肽可以位于距RTK 10 nm以内的位置，而不会干扰内源性生长因子结合位点。
结果与讨论
研究表明蜜蜂毒液和蜂毒肽可抑制配体诱导的EGFR和HER2磷酸化，从而动态调节乳腺癌细胞中的下游信号通路。蜂毒肽也可进入细胞，以直接或间接地方式调节下游信号传导途径。蜂毒肽对HER2驱动的肿瘤的选择性还为与HER2靶向药物联合使用提供了进一步的案例，蜂毒肽的膜破坏特性可以增强其细胞毒性有效载荷的内在动力学。
研究人员还揭示了修饰蜂毒肽特定区域的新机会，以进一步提高恶性细胞的效力和靶向特异性。经工程改造的靶向肽，例如RGD1-melittin，可以在静脉内递送，以实现更具选择性的归巢和摄取到肿瘤细胞中。但在人体试验之前，将需要进行进一步的研究这些肽的毒性和最大耐受剂量。
蜂毒肽可在全球范围内使用，并在一些偏远或不发达地区提供经济高效且易于使用的治疗选择。目前需要进一步的研究来评估某些基因型蜜蜂的毒液是否具有更强的或特定的抗癌活性可以加以利用。总体而言，此项研究结果可用于辅助开发与频繁耐药性和不良预后相关的多种癌症的新治疗方式。美迪西作为新药研发CRO也会持续关注此项研究进展，希望能为乳腺癌新药研发助力。
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