美问必答 | 攻克难关：小核酸药物研发突破指南

小核酸药物相较于传统的小分子化合物和抗体药物，具有更高的靶向性和特异性，这使得它们能够更有效地调控特定基因的表达，为治疗各种疾病提供了新的途径，在癌症、遗传性疾病以及病毒感染等方面展现出了巨大的潜力。然而，小核酸药物的研究也面临着一些重要挑战。当前，研究人员正致力于提高药物的稳定性，并优化其靶向性，以期能够更好地利用小核酸药物的治疗优势。

美迪西云讲堂邀请在化学领域经验丰富的田宝泉博士，为大家解答小核酸药物研发过程中的常见问题。并带您把握前沿动态,共同探讨小核酸药物的无限可能。

点击链接“https://www.medicilon.com.cn/video/small-nucleic-acid-opportunities.shtml”，回顾田宝泉博士的整场直播。

01 您好，请问您认为小核酸药物研发目前的难点在哪里？

田宝泉博士：在小核酸药物研发过程中，涉及多个关键步骤。首先是序列的筛选和优化，设计小核酸药物并不简单，需要考虑其与非靶向基因的非特异性结合及可能出现的脱靶效应。由于许多mRNA具有不同的转录本，必须仔细研究其不同之处，以避免剪接时靶基因序列的漏失。因此，序列筛选通常需要进行大规模筛选，以确保在靶基因的不同位点都有合适的候选化合物，这是一个技术难点。

其次是化学修饰，目前的化学修饰已能基本解决小核酸稳定性的问题。然而，随着临床数据的积累，必须不断发展化学修饰技术，以保持竞争力并避免被新一代药物取代。另一个关键点是递送系统，递送系统的开发面临着巨大的技术挑战，尤其是针对肝外靶向递送系统的开发。目前适应症较为狭窄，为了促进小核酸药物的快速发展，必须扩大其适应症范围。

最后，小核酸药物的药效、药代和毒理评估也是关键步骤。由于其特殊的性质以及国内并无上市的小核酸药物，探索准确评估小核酸药物的安全性和有效性的评价方法同样具有挑战性。此外，后续生产工艺的后期放大和成本控制也是小核酸药物研发中不可忽视的难题。

在国内，小核酸药物的研发正处于初步阶段，建立高效安全的评估体系尤为重要。这些问题都需要科研人员一一关注和不断的完善和解决。

02 糖环并四元环的核苷酸单体有在临床应用吗？是否只有临床前研究？个人觉得这个类型的核苷单体成本太高，是否不太具备性价比？

田宝泉博士：目前已有文献报道糖环并四元环的存在。在临床应用方面，有关于5’糖环并四元环破5‘-（E）-VP的专利，确实有一些已经应用于临床。然而，目前仅有这些例子，糖环并四元环在核糖本身的，在临床上尚未应用。在小核酸药物中，核糖成环状结构的锁核酸在ASO药物中确实有应用，例如采用gapmer结构的ASO药物中使用到了锁核酸的单体。、

关于价格高的问题确实存在，但是随着产业化的进程，成本的问题是能够解决的，例如我们在研发过程中，起初几千元一克的单体化合物已降至现在的约300元一克，工艺研发部门正在努力进一步降低成本。新型的核苷酸单体一旦开发成功，根据小核酸研发的平台优势作用，可在多个管线应用，成本相对分摊后将不再是主要问题。在新药开发中，化学修饰的选择至关重要，虽然核酸单体的开发成本需谨慎考虑，但技术和平台的进步使得化学修饰成为可行的选项。

03 单体的纯度对寡核苷酸合成纯度的影响？

田宝泉博士：确实是有影响，在我们的前期筛选阶段，通常对纯度的要求并不十分严格，有时候即使是95%的纯度也能够接受，98%的也是可以。然而，当进入后期工艺放大阶段时，即便是99%的纯度，如果单体中单杂含量超过了0.5%，会对后续纯化工艺造成显著的成本增加。因此，在单体质量控制方面，尤其是在工艺研发阶段，严格控制质量是必不可少的。

04 最近酶法合成寡核苷酸技术有所突破，对固相合成有影响？

田宝泉博士：是的，近期在寡核苷酸合成领域，酶法技术取得了显著进展。Alnylam等公司一直在推动酶法的固相合成方法，我参考的专利显示，不同于一次性合成，他们采用分段的方法，先将几个单体用固相法合成，再利用酶法特异性连接起来。酶法合成技术是否继续发展尚不得而知，但它已经可以与传统固相合成技术相比拟。在小规模合成中，酶法与固相合成技术表现相当，但要实现大规模生产，目前仍主要依赖固相合成。

当然，未来酶法技术的发展潜力巨大。两三年前，也有人问起酶法合成小核酸药物的可行性，那个时候确实只有固相合成这一个途径，而现在情况可能已有所不同。

05 初筛序列的时候是否需要进行修饰？

田宝泉博士：初筛的时候不需要修饰，在研发过程中，初始筛选阶段通常使用未修饰的裸序列。修饰通常在确认敲低率良好的序列后进行，因为若修饰方法不当，可能会导致敲除率严重下降。因此，我们不会在未经筛选的序列上直接进行修饰，以免增加其筛选失败的风险。

如果担心序列的稳定性问题，可以选择例如在3’端添加dTdT以增加其稳定性。通常情况下冻干粉形式的裸序列可以保持数月，而溶液状态下保持数周，其生物药效也不会产生大的改变。因此，在初期筛选阶段通常无需进行修饰，可以直接用裸序列进行筛选工作。

06 序列一开始就进行修饰设计的，和裸序列设计筛选后在修饰，哪一种更推荐？

田宝泉博士：建议首先进行裸序列的筛选。即使裸序列筛选工作良好，如果后续的修饰方法不当，体外往往无法表现出预期的效果，这种情况在实践中非常多见。因此，推荐先对裸序列进行筛选，然后再考虑进行修饰。首先确定一个优秀的裸序列，然后在此基础上进行不同的修饰，以验证哪种修饰方法能够保持其活性。

07 固相合成PS转PO高怎么办？

田宝泉博士：按照我的理解，在固相合成的时候，对于磷硫酰化反应后，确实会有磷酰化的。ASO药物通常全部使用硫代是比较安全的，而siRNA药物则仅在链端使用硫代基团。在链端个别磷酸硫代完后还要多次做磷酰化，因为无论是硫代还是磷酰化反应，都从亚磷酰胺转化而来，而亚磷酰胺非常活跃。在磷酰化过程中，很容易发生硫代被氧化，这可能导致硫代磷酰化的单体重新被氧化成磷酸。因为磷酸是通过碘氧化来引入的，这个过程中，需要精确控制氧化剂在固相柱上的停留时间，以确保反应迅速进行。如果控制不当，可能会导致硫代磷酸再次转化为磷酸。

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