多克隆抗体制备流程

原理

抗体：介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。
克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。

多克隆抗体（polyclonal antibody, pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫动物，可刺激机体多个B细胞克隆产生针对多种抗原表位的不同抗体。所获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。

多克隆抗体制备的意义

免疫血清：将抗原注入机体所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，含有这种特异性抗体的血清。
免疫血清作用：对传染病的诊断、预防和治疗有重要意义，而且对器官移植，肿瘤以及某些科研工作也有重要意义。

多克隆抗体优缺点

   优点 ：作用全面，具有中和抗原，免疫调理，介导补体介导的细胞毒作用，ADCC等作用，来源广泛，制备容易。
   缺点：特异性不高，易发生交叉反应，从而应用受限。

多克隆抗体制备流程

（一）免疫原的制备
（二）免疫动物
（三）免疫血清的收集
（四）免疫血清的鉴定
（五）免疫血清的保存

多克隆抗体操作步骤

一、免疫原的制备
免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity）
免疫原—天然抗原、人工  合成抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；
（一）细胞性抗原制备：
   绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素；
   细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清）
（二）可溶性抗原制备：指蛋白质、多糖和脂类等。
1）细胞的破碎（物理法、化学法）
2）提取与纯化：

    ①超速离心分离—是一种根据分离物质的比重特点，通过差速或梯度密度离心，将分子大小不同的抗原颗粒分开的方法，只适宜少数大分子物质的分离。
②选择性沉淀—选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境。
③超滤法—利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小的抗原物质进行滤筛。
④层析法—凝胶过滤、离子交换、亲和层析
⑤电泳——

3）鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。
（三）半抗原性免疫原的制备

    1.载体选择
常用载体：蛋白质、多肽聚合物、大分子聚合物。
（1）蛋白质类：常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蛋白等，其中以牛血清白蛋白最为常用。
（2）多肽类聚合物：是由人工合成的多肽聚合物，也是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。
（3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。
2.连接方法
         半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
物理法   是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主要有PVP和CMC等；
化学法   是利用某些功能基团把半抗原连接到白质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不同的方法进行连接。

（四）免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂(immunoadjuvant)，简称佐剂。 

二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素：
（1）动物的选择（选择动物时应考虑以下因素）
①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。
②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选用绵羊、山羊、马、驴等大动物。
③一般实验室采用的抗体，多用兔子和羊；
（二）佐剂
概念：预先与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。
种类：佐剂一般包括以下几类：
①无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等
②生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；
③人工合成佐剂：  如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；
④油剂：如弗氏完全佐剂、花生油乳剂等；
⑤纳米佐剂 
佐剂主要作用机制：
①改变抗原物理性状，延缓抗原的降解和排除，延长抗原在体内滞留的时间
②刺激单核-巨噬细胞系统，增强其对抗原的处理和提呈能力
③刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力.
（三）免疫乳剂的制备
（四）免疫动物

三、免疫血清的收集
采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则抗体效价会下降。
①颈动脉采血法
②心脏采血法
③静脉采血法
 
四、免疫血清的鉴定 
1.效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。
2.特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、免疫电泳法
3.纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳等方法。IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD），若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需进一步纯化。
4.亲和力的鉴定：测定抗体亲力的方法较多，如平衡透析法、ELISA或RIA竞争结合试验等。

五、免疫血清的保存
取好血后，放入37℃，30min后，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经3000rpm/5min分离血清，剩余放进-20℃冰箱保存。

以上是关于多克隆抗体制备的内容，来源于美迪西官网。

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