美研| CMC系列(十三)：X射线粉末衍射法在药物晶型定性分析中的应用

开篇引言

药物固态表征方法有很多，X射线粉末衍射（XRPD）、热重分析（TGA）、差示扫描量热（DSC）、红外（IR）、拉曼（Raman）、固态核磁（ssNMR）、动态水分吸附（DVS）、热台显微镜、扫描电镜（SEM）、偏振光显微镜（PLM）。其中，XRPD凭借快速、直观、样品用量少，样品不被破坏可回收的优点，已成为药物晶型研究的首选表征方法及金标准，广泛用于药物固态的定性和定量等研究，贯穿药物固态研究的各个阶段。

FDA Guidance: X-ray powder diffraction can also be used to provide unequivocal proof of polymorphism.

i. 《中国药典》2020年版第四部0451专门阐述了药品研究中X射线衍射法的应用；9015则指明了药品晶型研究及晶型质量控制。
ii. 美国药典（USP）941章节介绍了有关Characterization of Crystalline and Partially Crystalline Solids by X-Ray Powder Diffraction (XRPD)。
iii. 欧洲药典（EP 10.8）在《5.9 Polymorphism》和《5.16 Crystallinity》中对晶型定义阐明了XRPD用于药物晶型表征。
iv. 日本药典（JP XVII）中收录了晶型描述以及XRPD表征方法。

01 X射线衍射法和原理

X射线衍射法（XRPD, X-ray powder diffraction）是一种利用单色X射线光束照射到被测样品上，检测样品的三维立体结构（含手性、晶型、结晶水或结晶溶剂）或成分（主成分及杂质成分、晶型种类及含量）的分析方法。其原理是：X射线是一种高能电磁波，能够穿透物质并与其中的原子或者分子产生相互作用。当X射线照射原子排列规律不同的固体时，会产生不同的衍射图谱。因此，不同晶型的XRPD谱图往往差异很大，具有指纹属性，易于区分，如图1所示。

图1. 几何测量原理图

02 X射线粉末衍射（XRPD）图的组成

X射线粉末衍射图是化合物结构参数间接信息，变化万千，随物质结构不同而异。那么，该如何解读衍射图？

组成X射线粉末衍射图的三要素为：峰位、峰强、峰形（线形）。衍射峰强受晶体结构、样品特性（择优取向、吸收、孔隙率）和仪器参数影响。晶型是由化合物的晶胞参数（a,b,c,a,β,γ）定义的，而晶胞参数（a,b,c,a,β,γ）影响的是衍射峰的峰位置。其他检测指标如峰强度，则由原子参数决定，并受到择优取向的影响。

因此，判断晶型一致性时，取决于药物晶型衍射峰的位置，而不是衍射峰的强度或强弱顺序。

03 X射线粉末衍射（XRPD）的应用

1、区分晶态物质和非晶态物质（无定型）

中国药典2020版0451指出，晶态物质的粉末X射线粉末衍射峰是由数十乃至上百个锐峰（窄峰）组成；而非晶态物质的粉末X射线粉末衍射峰的数量较少且呈弥散状（为宽峰或馒头峰），如图2所示。

图2.某一化合物结晶态和无定型的XRPD对比图

2、鉴别多晶型

当某一化合物有两种或两种以上的不同固体物质状态时，即存在有多晶型（或称为同质异晶）现象。

多晶型现象可以由样品的分子构象、分子排列规律、分子作用力等变化引起，也可由结晶水或结晶溶剂的加人（数量与种类）形成。不同晶型的XRPD图在衍射峰数量、衍射峰位置、衍射峰强度以及衍射峰的形状上显现出差异。

化合物的每一种晶型都会产生一种特有的X射线粉末衍射图，XRPD图可以作为晶体的指纹图谱，用于鉴定区分不同晶型，如图3所示。

图3. 某一化合物不同晶型的XRPD对比图

3、评估物质的结晶度

当化合物结晶状态比较好、结晶度比较高时，XRPD图基线水平，峰形尖锐。反之，结晶度低时，基线不水平，出现漫散包，峰不尖锐，峰形宽化。

结晶度用来表示物相中结晶态物质所占的比例，同一种晶型，一般结晶度越高，熔点越高，如图4所示。

图4.同一晶型不同结晶度的XRPD对比图

04 XRPD在晶型鉴别方面常见的问题

多数情况下，晶型的判断并不困难。只要其XRPD谱图一致（所有的衍射峰位置一致），就可以判断为同一晶型。但是在实际晶型鉴别中，我们也会经常遇到以下问题：

i：单一晶型还是混晶？
ii：相似的XRPD图，晶型是否一致？
iii：XRPD多峰或者少峰，晶型该如何判断？
iv：XRPD峰偏移，晶型该如何判断？
v：XRPD峰分叉晶型又该如何抉择？

1、培养单晶，通过和单晶模拟的粉末衍射图比对

单晶是判断晶型是否为单一晶型最直接的方法。通过培养目标晶型的单晶，然后通过单晶数据模拟XRPD谱图，与实测XRPD谱图进行对比。如果一致，则说明是单一晶型，如图5所示。

图5. 某化合物单晶模拟和实测的XRPD对比图

2、通过不同的结晶方式，获得多批次样品的XRPD

若多批次重结晶实验（采用不同的结晶方式，不同的溶剂体系）获得样品的XRPD图一致，那么就可以认为是单一晶型，如图6所示。

图6.某化合物不同结晶方式获得的XRPD对比图

3、结合不同表征技术进行全面的表征

DSC等辅助手段也可以用于是否单一晶型的判断。如果是单一晶型，那应该有单一的熔化峰。如果DSC检测有两个或者多个熔化峰，则有可能是混晶。NMR、TGA、KF等则可以对水合物、溶剂化物的情况进行判断。

4、晶型标准谱图对比

和对照品XRPD图对比，和专利文献报道的XRPD谱图对比，以确定当前制备的晶型是混晶还是单一晶型。

同种物质（单一成分或者包含溶剂）的不同晶型可能晶体结构相似。比如无水物和水合物之间，不同含水量的水合物之间，无水物和溶剂合物之间，水合物和溶剂合物之间，不同的溶剂合物之间就可能晶型结构相似，简称isostructural。

此外，不同物质其实也可能具有相似的结构（即相似的XRPD图），比如氘代和非氘代化合物，异构体。对于这些情况，仅从XRPD图谱是很难判断的。需要结合项目背景信息，比如合成工艺，结晶工艺、化合物的多晶型情况，还需要结合其它表征手段综合分析，才能得到客观科学的结论，如图7-图9所示。

图7.氘代和非氘代的XRPD对比图

图8.对映异构体（苹果酸）的XRPD对比图

图9.某新药不同溶剂合物的XRPD对比图

在进行晶型一致性判断时，少峰的情况（与标准品对比）相对问题较小，可以认为是该批次样品可能由于结晶情况与以往批次不同，导致某个或者某些晶面结晶度比较低，因而没有出峰。比较难判断的是XRPD谱图多峰的情况，出现多峰的情况，一定要引起重视。

择优取向常发生在片状和针状晶体。比较极端的情况，某些比较弱的衍射峰会消失，但对其研磨后衍射峰会出现。无论是片状晶体还是针状晶体，在研磨后，样品的形貌会趋向于不规则和随机的分布，此时每个晶面暴露在X射线下的概率也会趋向于一致，所以XRPD衍射峰就没有明显的择优取向。当然，研磨有可能会导致样品结晶度下降，甚至变为无定形，所以研磨时要注意研磨的强度和时间，如图10-图13所示。

图10.混晶引起的XRPD多峰图

图11.外来物引起的XRPD多峰图

图12.溶剂引起的XRPD多峰图

图13.择优取向引起的XRPD多峰图

峰偏移经常发生在水合物脱水前后或者样品热处理前后的XRPD图上。非化学计量比水合物与对应的无水晶型具有相似的晶体结构，只有少数衍射峰有差异。脱水后，晶格收缩，晶面间距减小，导致衍射峰右移。

同样，温度对于XRPD的位置也有影响。热胀冷缩是一个物质的基本属性，同样适用于晶体。根据布拉格公式2d sin θ=n λ，温度升高，晶体膨胀，在波长不变的情况下，晶面间距d值增大，必然使sin θ 变小，即峰位左移。

另外，样品受到挤压，产生均匀的颗粒应变，比如压片，亦可能导致峰位右移。具体如图14和图15所示。

图14.水合物脱水引起的XRPD峰偏移图

图15.受热和应力存在引起的XRPD峰偏移图

在XRPD谱图分析时，如果遇到峰裂分等情况时，可能是颗粒表面粗糙度、颗粒太大、晶体结构缺陷等因素引起，研磨再测试可以解决大部分的问题。具体如图16所示。

图16.氯化钠不同颗粒大小引起的XRPD峰分叉图

05 美迪西的技术和服务

美迪西药物固态开发技术平台具有专业和经验丰富的盐型/共晶筛选、晶型筛选、单晶培养和结构解析、晶型定性定量研究团队。团队主要负责人曾担任多年的固态表征CNAS授权签字人，拥有10年以上固态表征分析技术经历，上百个API或制剂中API的晶型定性研究经验，能够为客户提供高效优质的固态表征技术服务，赋能您的药物开发。

[1] 《中国药典》(2020年版)中0451 X射线衍射法
[2] 〈941〉 CHARACTERIZATION OF CRYSTALLINE AND PARTIALLY CRYSTALLINE SOLIDS BY X-RAY POWDER DIFFRACTION (XRPD).
[3] PECHARSKY V K, ZAVALIJ P Y. Fundamentals of Powder Diffraction and Structural Character of Materials [M]. Spring-er, 2005:161.

美研|CMC系列回顾

❖ CMC系列(一)|浅谈药物研发中原料药工艺研究的重要性

❖ CMC系列(二)|药学研究之世界银屑病日

❖ CMC系列(三)|高端吸入药物的市场格局和研究现状

❖ CMC系列(四)|浅谈手性药物的研究策略

❖ CMC系列(五)|药物晶型控制策略

❖ CMC系列(六)|含氮类化合物-可挥发碱性有机胺的气相分析

❖ CMC系列(七)|新药研究中的固态开发挑战及应对策略

❖ CMC系列(八)|浅析ICH指导原则Q3C及未收录残留溶剂限度制定方法

❖ CMC系列(九)|定量核磁应用及其方法验证/定量核磁那些事儿

❖ CMC系列(十)|药物杂质研究策略之基因毒性杂质

❖ CMC系列(十一)|手性化合物的拆分策略与经验分享

❖ CMC系列(十二)|单晶结构解析在药物开发中的应用和单晶培养哪些事儿