【专家报告】马兴泉博士：小核酸药物研发中的药物化学

2023年3月24号，美迪西生化学部高级副总裁马兴泉博士在IDC2023第四届化学新药与改良型新药研发论坛中做了主题为《小核酸药物研发中的药物化学》的报告。

嘉宾介绍

马兴泉 博士 美迪西化学部高级副总裁

中国科学院上海有机化学研究所生命有机国家重点实验室获得博士学位，美国国家卫生研究总署(NIH)访问学者，曾担任美国斯克利普斯研究所（TSRI） 副研究员。拥有20多年企业药物研发经验。马博士背景是糖化学，在糖化学与生物学领域有较为广泛的研究，对中草药活性成分皂甙的分离、提取以及化学合成积累了较为丰富的知识和经验，对前沿领域的多糖大分子缀合物例如糖脂、糖肽、糖蛋白的合成以及生物活性有多年的研究与积累。在国内外核心期刊发表20多篇学术论文，包括JACS, ANGEW, LANGMUIR, OBC, JMCL等。马博士2018年加入美迪西，搭建南汇研发中心团队，领衔创建了美迪西PROTAC、ADC、小核酸等药物研发平台， 对多个前沿药物研发领域有深入的钻研和见解。

01 小核酸药物的历史

小核酸药物的发展基于1940年DNA的发现，在这八十多年的时间里有以下几个关键的节点：

1998年FDA批准了首款ASO药物Fomivirsen，用于治疗巨细胞病毒(CMV)视网膜炎；

2004年全球首款核酸适配体药物Macugen获批上市，靶向VEGFR，用于治疗老年湿性黄斑变性；

2018年全球首款 siRNA药物Onpattro (Patisiran)由FDA批准上市,用于由 hATTR 引起的多发性神经病患者的治疗。

可以看到小核酸药物的发展历史称得上厚积薄发，而且最近小核酸药物的火热已经超出了PROTAC和ADC，成为药物研发届的新宠儿。因为小核酸药物的机制是在遗传物质的根本层面解决问题，这一点对比传统小分子药物和抗体药物具有巨大的优势，所以随着对小核酸药物的开发不断深入，未来会有更多的曾经认为不可成药的靶点被攻克。

02 小核酸药物的研发核心是药物化学

小核酸药物包括siRNA, miRNA, Antisense oligo, CpG oligo, Aptamer等，其药物研发过程并不像我们想象的那么复杂，它其实是一个很简单直观的皆是可以通过药物化学方法合成的化学药物，所以小核酸药物的药物研发主要围绕化学合成和化学修饰这两个重心。

截至目前，已经有16款小核酸药物获批上市，主要以ASO为主，但近几年siRNA的数量有增加趋势，其中肝靶向的小核酸药物比较多，应用范围也更广泛。

第一个小核酸药物Fomivirsen，也就是之前说的1998年的第一个ASO药物，与天然核苷酸相比，对2位的羟基进行了脱氧，用硫取代了磷酸上的氧，这就是小核酸药物中最基础的化学修饰，被称为第一代化学修饰的磷酸骨架修饰。

2004年的第一个适配体药物Pegaptanib在核糖上加了一个甲氧基。

2016年获批上市的PMO药物Eteplirsen中用以连接的磷酸修饰成了磷-氮，与之类似的PMO已经有3个获批上市

2018年获批上市的Patisiran是第8个成功上市的核酸药物，也是第一个siRNA，由于它是双链的RNA结构，所以化学结构上明显比ASO和PMO要复杂得多。

在这段时间里，除了siRNA横空出世，用乙二醇对单体进行修饰改造的小核酸药物上市比较集中，这也是第二代化学修饰。

2019年的Givosiran是第一个用到GalNAc递送系统的siRNA，对于整个核酸药物的研发具有划时代的意义。不同于之前LNP脂质体递送系统，GalNAc的三个氨基半乳糖显示出了高度的选择性和靶向性，在肝脏中具有靶点特异性。

目前还有一种在研的是cEt Containing Gapmer，结构比较复杂，仍处在探索研究阶段。

对小核酸药物进行化学修饰有利于提高药物的稳定性、利用度，甚至对药效药代也有提升。随着对化学修饰技术的更新换代，小核酸药物的药物活性也得到了不断地提升，主要体现在给药频率和剂量上。

03 核酸药物的递送系统

现在递送系统的种类也越来越多，这里统计展示了9种递送系统：

这里很多种类型还没有经过市场的成功检验，像第三种用抗体桥接做siRNA的递送系统目前还没有上市的药物，但已经有很多人在研究了。我们重点还是讲讲LNP和GalNAc。

LNP在人体内具有免疫原性且为改变性状的脂质体不能靶向递送药物，LNP中胆固醇占比较大，因为微观结构上看，胆固醇的骨架大，水溶性比较弱，能撑起球形、盘型的结构。

GalNAc不表现出免疫原性，所以更加安全。GalNAc靶向肝细胞上的ASGPR位点，可通过内吞作用被吸收，副作用更小。

04 美迪西核酸药物研发经验

美迪西核酸药物研发服务平台是集成了药物发现、生产和临床前研究的一体化综合性平台，可以完成核酸药物的化学合成和修饰、体内外pkpd的检测。经过将近4年的研发历程，美迪西核酸药物研发服务平台积累了丰富的经验，目前有超过10个的on going项目，超过50个致力于核酸药物研发的化学家组成科研团队，构建了超过100个可使用的单体。

基于严谨的科学态度、开放的技术平台、丰富的研发经验和先进的仪器设备，我们可以满足行业对于前沿创新核酸药物的研发需求

05 寡核苷酸化学合成的流程

总体来说，每新增一个碱基需要经历一下4个步骤：DET、CPL、CAP、OXI。

1. 脱保护（Deprotection, DET）：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；

2. 缩合连接（Coupling, CPL）：将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应；

3. 加帽反应（Capping，CAP）：缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，可用乙酸酐和1-甲基咪唑终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；

4. 氧化稳定（Oxidation, OXI）：在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。

重复以上循环直到需要合成的碱基全部连接完成，然后进入Ammonolysis氨解反应。

氨解反应通过不同的仪器也有两种反应，一种是气相的，一种是液相的。氨解后需要进行冻干或者超离心，用去离子水洗涤，再进行分析和纯化。注意，在这些步骤里，水的含量需要重点关注。因为水的含量如果过高，容易发生副反应，对于结果会产生不良影响。

对于寡核苷酸的分析美迪西主要使用UPLC和HPLC这两种仪器。HPLC的检测结果纯度一般可以达到80%以上，UPLC和QTOF联用检测的纯度也是80%以上。这里我们可以看到试验结果的峰值图谱，一般小于500 ppm的结果都是准确的。

纯化会用到制备HPLC，纯化后核酸药物样品的浓度能达到98%以上。第二种方法是是用AEX HPLC，阴离子交换高效液相色谱纯化的寡核苷酸必须没有多余的盐，这一点很容易通过使用脱盐柱实现。

这是一个合成siRNA的例子：

可以看到经过制备HPLC纯化后siRNA的纯度达到了92%，图谱上的峰型没有那么锋利，事实上这跟最左边5’上的磷-硫键有关，可能出现的手性结构导致数据的结果不完美。

06 美迪西核酸药物研发服务平台

美迪西可以提供单体合成、修饰；寡核苷酸合成；递送系统合成以及寡核苷酸偶联物的合成。已经建成的siRNA库，不仅有丰富的单体库存，而且拥有庞大的单体合成砌块库，可以快速完成各类修饰单体的合成。美迪西拥有专业的小核酸药物的研发团队可以提供高效快捷地研发服务；已有多个siRNA药物FTE项目完成和进行中。

在生物活性评价服务上可以进行：

1. siRNA-GALNAc与靶向肝细胞的结合评估（ELISA,SPR,FP,FACS,MSD,Confocal 显微镜）

2. 靶标mRNA/蛋白质水平降低评估（RT/Q-PCR,Western blot)

3. 细胞表型和功能性干扰的评估（细胞增殖，迁移，蛋白质修饰和互作）

4. 脱靶效应评估

07 小结

核酸药物作为继小分子化药和抗体药物后的第三大类型药物，在全球已经形成燎原之势，发展势头迅猛，成为生物医药企业研发的重点和热点。

核酸药物研发速度极快，靶向性高，有望突破传统药物无法解决的“不可成药”的靶点。在研发过程中，药物化学是核心和重点。

美迪西核酸药物研发服务平台拥有丰富的核酸药物研发经验，可以快速完成各类修饰单体的合成，制定开发路线，满足行业对于前沿创新核酸药物的研发需求，为医药公司及科研单位提供核酸药物发现、筛选及临床前研究服务。

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