Ames试验-细菌回复突变试验

ICH推荐的标准遗传毒性试验组合

组合一

    a.细菌回复突变试验
b.体外染色体畸变试验或体外微核试验或体外小鼠淋巴瘤tk试验，这三个试验可以任选其中一个。
c.体内微核试验或体内骨髓细胞染色体畸变试验；动物给药后取外周血淋巴细胞做细胞遗传学分析也可接受，但不常用。

组合二

    a.细菌回复突变试验
b.用两种不同组织做体内遗传毒性评估，通常包含体内微核试验和另一个体内试验。第二个体内试验通常选择评估动物肝脏DNA链断裂。
细菌回复突变试验是与致癌物检测最相关的体外试验。

细菌回复突变(Ames)试验

•             用于检测DNA损伤引起的基因突变。通过检测受试物在测试菌株某些特殊构建的突变体上引起突变的能力，即造成菌株从组氨酸/色氨酸依赖型向原养型突变，判断受试物是否为致突变剂。

•             试验需在加和不加s9代谢活化系统条件下同时进行。

•             ※在培养细菌的琼脂培养基中加入痕量的组氨酸或色氨酸，允许细菌前几个小时生长，表现为背景菌苔。当加入的组氨酸/色氨酸用尽后，只有发生了突变的细菌才可以继续生长成为肉眼可见的回复突变菌落。

不同类型的Ames试验

GLP试验用标准Ames试验。
在药物筛选早期常用的试验有Mini-Ames试验、Micro-Ames试验、AmesII试验等，特点是用药量少。
Mini/Micro Ames试验通常选择2个菌株（即TA98和TA100，可检测98%致突变剂），为了消除另外2%的可能性，可选择与标准Ames试验相同的5个菌株。
AmesII试验使用菌株TA98和混合菌株TA7001至7006，将细菌与受试物预培养及一系列稀释后，在30℃培养过夜，然后接种到各有选择性试剂5-FU及pH敏感剂溴甲酚紫的384孔上，通过紫外分光光度计检测培养基变黄的程度来判断受试物致突变性。

Ames试验流程

受试物		浇到平板，孵育48-72小时
菌液
S9混合物/PBS

测试菌株（Ames Test System）

应选择至少5种菌株

•             TA1535

•             TA1537或TA97或TA97a

•             TA98

•             TA100

•             WP2 uvrA或WP2 uvrA(pKM101)或TA102

每种菌株在编码组氨酸/色氨酸生物合成的操纵子上有不同的突变。
国外较多实验室选用WP2，而国内使用TA102较多。

测试菌株基因型和突变类型

测试菌株基因型及检测敏感性

Rfa膜突变的存在增加了细胞膜对大分子化学物质的通透性
uvrB-菌株的切除修复功能有缺陷，菌株无法切除DNA加合物，是的这些菌株对大量致突变剂的致突变性和细菌毒性敏感。
质粒pKM101上含有muc+基因，参加DNA损伤诱导的DNA修复途径，在给予细菌抵抗致突变剂的细菌毒性同时，提高了易突变性。含有质粒pKM101的菌株自发回复突变菌落数较高。

TA1537、TA97和TA97a均含有胞嘧啶的重复序列，位于相应的组氨酸靶位点内的突变敏感部位，他们对导致这些移码热点中碱基缺失的移码诱变剂的敏感性相似。

TA98和TA100对大部分致突变剂敏感（有数据显示这两个菌株检测阳性的致突变剂占98%，因而在前期筛选试验中可只检测这两个菌株。）
羟基蒽醌类化合物仅可被菌株TA1537检测
氧化型突变剂、DNA交联剂剂联氨仅可被含有AT位点突变的菌株TA102、WP2urA、WP2uvrA(pKM101)检测
菌株TA1535与TA100都在hisG46基因位点发烧碱基置换型突变，不同点仅是TA100含有pKM101质粒，从而增加突变敏感性。但是专家组通过大量数据显示，在已知的659种致突变剂中约5%受试物仅可被TA1535检测出，而不是TA100。

溶媒的选择

•             水：水溶性化合物

•             二甲基亚砜(DMSO)：无水溶性化合物首选

•             乙醇

•             丙酮

•             不常用溶媒：设立平行阴性对照

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