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Ames试验-细菌回复突变试验

2017-07-19
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Ames试验

ICH推荐的标准遗传毒性试验组合

组合一

细菌回复突变试验;
体外染色体畸变试验、体外微核试验或体外小鼠淋巴瘤tk基因突变试验(三者任选其一);
体内微核试验或体内骨髓细胞染色体畸变试验。
此外,也可在动物给药后取外周血淋巴细胞进行细胞遗传学分析,但该方法较少采用。

组合二

细菌回复突变试验;
采用两种不同组织进行体内遗传毒性评估,通常包括体内微核试验及另一项体内试验。第二项体内试验一般用于评估动物肝脏中的DNA链断裂情况。
细菌回复突变试验是与致癌性检测较为相关的重要体外试验。

什么是细菌回复突变(Ames)试验

该试验用于检测化合物是否具有致突变性。其原理是通过观察受试物是否能使特定突变株恢复生长能力(即由组氨酸/色氨酸依赖型突变为原养型),以判断受试物是否具有引起基因突变的潜在作用。
试验应在有无S9代谢活化系统的条件下同时进行,以评价受试物在代谢前后可能产生的致突变效应。
※在培养细菌的琼脂培养基中加入少量组氨酸或色氨酸,使细菌能够在短时间内生长形成背景菌苔。当培养基中的组氨酸/色氨酸被耗尽后,只有发生回复突变的细菌才能继续生长,形成肉眼可见的菌落。

不同类型的Ames试验

实验类型培养器皿实验时间受试物用量
标准Ames100mm细胞培养皿两周400mg
Mini-Ames六孔细胞培养板1周(1)80mg测试五个菌株
(2)30mg测试两个菌株
Micro-Ames24孔细胞培养板1周15mg
Ames II384孔板1周< 5mg

GLP试验用标准Ames试验。
在符合GLP规范的遗传毒性研究中,通常采用标准Ames试验进行致突变性检测。
在药物筛选早期,常用的快速筛查方法包括Mini-Ames试验、Micro-Ames试验和Ames II试验等。这些方法的共同特点是所需样品量较少,适合早期开发阶段使用。
Mini-Ames或Micro-Ames试验通常选择两个菌株(即TA98和TA100,可检测98%致突变剂),为了消除另外2%的可能性,也可选用与标准Ames试验相同的五个菌株进行测试。
Ames II试验采用菌株TA98以及混合菌株TA7001至TA7006。该试验将细菌与受试物共同预培养,并经一系列稀释后,在30℃条件下培养过夜。随后,将菌液接种到含有选择性试剂5-FU和pH指示剂溴甲酚紫的384孔板中,通过紫外分光光度计检测培养基颜色变化(变黄程度),以评估受试物的致突变潜能。

Ames试验流程

受试物1.jpg浇到平板,孵育48-72小时3.jpg
菌液
S9混合物/PBS2.jpg


测试菌株(Ames试验系统)

在Ames试验系统中,应选择至少5种测试菌株,通常包括:

  • TA1535

  • TA1537、TA97或TA97a

  • TA98

  • TA100

  • WP2 uvrA、WP2 uvrA(pKM101)或TA102

各菌株在编码组氨酸或色氨酸生物合成相关基因的操纵子区域中含有不同类型的突变,用于检测不同机制的致突变作用。
国外多数实验室常选用WP2菌株,而国内实验室则更常采用TA102菌株。

测试菌株基因型和突变类型

菌株氨基酸标记物其它相关突变质粒
突变基因突变类型主要基因靶点膜突变DNA修复
TA1535hisG46碱基置换GCrfaUVrB-
TA1537hisC3076移码GCrfaUVrB-
TA97hisD6630移码GCrfaUVrBpKM101
TA97ahisD6631移码GCrfaUVrBpKM101
TA98hisD3052移码GCrfaUVrBpKM101
TA100hisG46碱基置换GCrfaUVrBpKM101

WP2 uvrA

trpE碱基置换AT-UVrA-

WP2 uvrA

(pKM101)

trpE碱基置换AT-UVrApKM101
TA102hisG428碱基置换ATrfa+

pKM101

pAQ1

测试菌株基因型及检测敏感性

Rfa膜突变的存在可增加细胞膜对大分子化学物质的通透性,从而提高受试物进入细胞的效率。

uvrB⁻菌株的切除修复功能存在缺陷,无法清除DNA加合物,使得这些菌株对多种致突变剂表现出更高的致突变性和细菌毒性敏感性。

质粒pKM101上含有muc⁺基因,该基因参与DNA损伤诱导的修复途径。在增强细菌对致突变剂毒性耐受性的同时,也提高了菌株的突变敏感性。因此,含有质粒pKM101的菌株自发回复突变菌落数相对较高。

TA1537、TA97和TA97a菌株均含有胞嘧啶重复序列,该序列位于组氨酸基因靶位点内的突变敏感区域。它们对能引起碱基缺失的移码型诱变剂具有相似的敏感性。

TA98和TA100对大多数致突变剂均较为敏感(有数据显示这两个菌株检测阳性的致突变剂占98%,因而在前期筛选试验中可以只采用这两种菌株进行检测。)

羟基蒽醌类化合物主要可由菌株TA1537检测到。

氧化型突变剂、DNA交联剂及联氨等则仅能被含有AT位点突变的菌株(TA102、WP2 uvrA或WP2 uvrA(pKM101))检测到。

菌株TA1535与TA100均在hisG46基因位点发生碱基置换型突变,区别在于TA100含有质粒pKM101,从而具有更高的突变敏感性。然而,专家组研究数据显示,在已知的659种致突变剂中,约有5%的受试物仅能被TA1535检测出,而无法通过TA100检测。


溶媒的选择

  • 水:水溶性化合物

  • 二甲基亚砜(DMSO):无水溶性化合物首选

  • 乙醇

  • 丙酮

  • 不常用溶媒:设立平行阴性对照


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