新药发现阶段高通量ADME研究

在最近的十几年内，药物的发现和开发的周期越来越长、试验花费越来越多。在西方国家，开发上市1个新化合物实体需要10～15年的时间，花费超过8亿美元。10000个新化合物实体中，有10个进入临床阶段研究，但只有一个候选药物最终能够上市。即使已经上市的药物也存在因不能接受的药物不良反应而撤市的可能。因此新药研发是一种“高风险、低效率的过程”。 对于创新药物的研发，其过程由3个阶段、4个步骤组成：

①靶位的发现、特性与评价(生物靶标阶段)；
②先导化合物的发现和优化(药物发现阶段)；
③ADMET(吸收、分布、代谢、排泄和毒性)、PK、PD研究(药物发现和开发阶段)；
④临床试验(药物开发阶段)。

为了使更多药物上市，可以采取两个措施：一是提高筛选化合物的数量，这受到各种条件的限制，如经费、时间、资源、规模的限制；二是提高研发的成功率，如采取合理药物设计、药物发现阶段的ADMET研究等。显然提高研发的成功率更受研发单位的青睐。在1990年进行的回顾性研究中，发现之前在临床阶段失败的候选药物里约40％是由药代动力学方面的原因造成的。制药界已经认识到，对于具有靶位活性和选择性的候选药物，如果其ADME特性达不到类药性要求，则这个候选药物同样不能最终成为药物。为此新药研究者将药物发现后期的ADME研究提前到药物发现早期阶段，使不符合类药性的化合物及早被淘汰，提高研发的成功率。经过数十年的研究，2000年的统计结果显示，在临床阶段失败的药物中，因PK原因而淘汰的比例已经大大下降。
在药物发现阶段开展ADME研究，面临的问题是需要测试的化合物种类庞大(这得益于组合化学和平行合成技术的发展)、所需试验的项目多，而每个化合物的量却很少。这需要对已有的测试方法进行微量化、自动化和高通量改进，使化合物的测试速度与组合化学的合成速度相匹配。此外，在实验流程设计上，为加快新药研发的速度而采用平行(parallel)操作的方法，将相关的研究同时进行。以往多采取顺序(serial)研究的方法，即完成一项试验后再进行下一项，其效率很低。未来的方法是开展虚拟库筛选结合平行操作，利用所建立的构效关系，在不合成化合物的情况下，对虚拟的化合物库进行筛选，从而大大节省资源、加快药物发现的速度。
在药物研发阶段，开展的ADME研究有：虚拟方法(in silico)或称计算方法(computational method)；体外方法(in vitro)；体内方法(in vivo)。这3种方法各有其优缺点。

    利用高通量筛选技术可以快速鉴别先导化合物，但通过组合化学构建的化合物库，首先是存在结构多样性差的问题，这降低了化合物开发的成功率；其次是化合物的类药性差，使大量的化合物在ADME筛选期间被淘汰，增加了实验成本。过去的20年，虽然药物发现阶段的新技术层出不穷，但每年上市的新化合物实体却没有实质性增加。另外，目前所建立的高通量测定方法多数与所试验的化合物结构类别有关，并不具有完全的通用性。

一、虚拟筛选方法

虽然已经开发出了许多体内和体外微量化、简单化、自动化的实验方法，在分析时间、劳动强度、处理化合物的数量方面已经得到了很大的改善，但实验方法仍然被认为是慢速的、花费大、且需要进行候选化合物的合成。虚拟筛选方法可以看作是一种替代方法，用于预测候选化合物的ADME特征。该方法具有高通量或超高通量。

（一）小肠吸收预测

口服吸收与药物在胃肠道内容物中的溶解度、解离度以及跨过胃肠细胞膜的能力有关。因此化合物的理化性质是其小肠通透性的重要决定因素。提高药物口服吸收的方法有：
1. 基于Lipinski的五规则(role of five)方法。在化合物结构中将N和O原子看作成氢键的受体，而将N—H、O—H基团看成是氢键的供体。通过软件计算醇水分配系数ClgP。如果一个化合物满足下列两个以上条件：
    ●氢键供体数>5
    ●氢键受体数量>10
    ●ClgP>5
    ●MW>500Da
    则这个化合物将被给予开发警告标志，未来的成药性有疑问。本方法不适合存在主动转运机制的口服药物预测。
2.第二种方法也是利用Lipinski的五规则，但结合亲脂性和分子大小信息，判定化合物口服吸收时的被动吸收情况。将化合物的内在亲脂性(考虑到在生理pH下的解离度)ClgD与测定分子大小的参数计算分子折射率(calculated molecular refraction，CMR)进行绘图。化合物被分成了4个象限，在第1和第3象限，化合物具有适当的亲脂性，可以进行跨膜转运；在第2象服，化合物的分子小、亲水性强，可以通过细胞间隙吸收；而在第4象限的化合物因分子量大、亲水性强，使化合物跨膜吸收困难。根据化合物所在的象限不同就可以对化合物的通透性作出预测。
3．采用分子极性表面积(polar surface area，PSA)作为药物吸收的预测方法。研究表明：PSA和分子量与通过Caco-2细胞获得的表观通透性指标具有相关性。

（二）血脑屏障(BBB)的通透能力预测

在新药发现阶段，对作用于中枢神经系统的药物需要该药物具有一定的BBB透过能力，而对于作用于外周的药物，要求其透过BBB的能力越低越好，以减少药物的中枢神经系统的不良反应。为此需要进行候选药物透过BBB的能力预测。
Van de Waterbeemd给出了一种BBB通透性预测方法，MW<450 psa="">90Å被认为具有BBB透过能力。但该方法没有考虑P-gp的影响。

（三）代谢稳定性的预测

要获得最佳的生物利用度需要有适当的吸收和代谢稳定性。目前已知化合物的脂溶性、分子大小和形状、存在的功能团和位置影响着药物的体内稳定性。其原因可以归结于化合物的结构能否进入P450的结合催化位点。有关这方面的模型还处在发展初期。
据报道，目前虚拟筛选方法的预测能力在60％～90％之间，且使用的经验模型与所采用的化合物训练集有关。未来需要采用更多结构各异的化合物对模型进行验证，还需要搞清楚体内ADME机制，建立机制模型进行预测。

二、体外方法

在过去的10多年里，体外方法已经被广泛用于通透性、生物利用度、代谢稳定性、药物相互作用以及药物理化参数的决定。体外方法的优点一是可以采用微量化、自动化等手段建立高通量或中等通量的模型；其次是可以使用来自人体的组织细胞成分进行研究，以消除人类和动物之间存在的种属差异，提高药物研发的成功率。但体外研究缺乏体内研究所存在的血流、生化因子以及多种转运蛋白等影响因素，另外，化合物配制过程中使用的有机溶剂可能会掩盖药物在体内的溶解性能、影响药物代谢酶的活性。

（一）小肠吸收的评价模型

药物进入体内循环，需要在口服给药后经过胃部的低pH环境，进入十二指肠和小肠，经过溶出释放后在小肠上皮细胞吸收入血。小肠上皮细胞吸收的方式有4种：跨细胞摄取、细胞间透过、载体介导的摄取以及载体介导的流出。目前已经开发出了几种体系来评价药物的口服吸收。常见的有Caco-2细胞系、MDCK细胞系、PAMPA人工膜方法。其中PAMPA是基于被动扩散方式的吸收评价模型，属于高通量研究方法，而Caco-2细胞系、MDCK细胞系属于低通量方法。

（二）代谢稳定性研究

药物进入体内后作为外来物将经历由药物代谢酶所致的生物转化。虽然有时存在于小肠上皮细胞的P450同工酶，如CYP3A4，可以导致药物首关效应，但肝是体内最大的代谢器官。肝中存在Ⅰ相代谢酶如P450酶、非P450酶如酯酶、黄素依赖单氧化酶、单胺氧化酶等；Ⅱ相代谢酶如葡萄糖醛酸转移酶、磺基转移酶等。上述酶中，P450酶又是体内主要的代谢酶。在P450的同工酶中，CYPlA2、CYP2A6、CYF2B1、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4是与药物代谢有关的酶，其中CYP3A4又是P450酶中含量最大、代谢药物比例最高的酶，可以占到代谢药物总数量的50％。代谢稳定性是药物的一个重要特性，代谢不稳定的药物需要频繁给药才能保持药物的治疗浓度。
由于代谢方面存在种属差异，在药物研发阶段使用来自人体的组织、细胞获得的结果与临床结果更接近。在酶代谢稳定性研究中使用的体外系统主要为人类肝微粒体、肝细胞。目前已知肝微粒体含有的P450酶及其比例与肝组织中的比例接近，肝微粒体易于保存，可进行高通量的酶稳定性研究。肝细胞中含有完整酶系，不需要添加辅助因子，但肝细胞保存时间短、来源受限。

（三）理化参数的确定

在药物发现阶段，候选化合物的理化参数，如溶解度、解离常数、亲脂性等影响着药物的吸收、分布、代谢和排泄，因此有必要在药物发现阶段对这些理化参数进行确定。目前已经开发出高通量的理化参数确定方法。
1. 溶解度
经典的溶解度测定方法为摇瓶法，因测定时需要达到饱和状态，因此试验周期长(最长可达7天)，使用药物量大，不适合高通量研究。人们后来开发了多种高通量测定溶解度的方法，在药物发现阶段常用的有比浊法和UV测定法，这两种方法每天可以测定上百个化合物的溶解度。
2. 亲脂性
亲脂性表示化合物或其中部分基团对亲脂性环境的亲和能力。一般用化合物在两相的分布行为表示，如正辛醇—水分配系数。亲脂性可以用于预测药物的通透性和代谢稳定性。一般地，化合物的亲脂性越强(如lgD>5)，则该化合物的膜通透性越强，在体内越容易被肝药酶代谢；而亲水性的化合物(1gD<0)，则不容易透过细胞膜，在体内易于被肾排泄。一个合适的药物，亲脂性lgD在0～3之间，在体内表现出溶解性和亲脂性的平衡。常用的测定方法有摇瓶法，其原理是将待测化合物溶解在缓冲液中并加入一种不相混溶的溶剂，达到平衡后分离两相，测定水相的pH，以及化合物在水相和有机相的浓度。计 算出的脂溶性是在特定pH时部分解离状态下的分配系数，用lgD表示。如果采用的是化合物不解离系统如中性系统，则计算的结果为lgP。脂溶性的高通量测定方法有HPLC方法，测定化合物在流动相和非极性固定相(如C。键合相)之间的分配系数来确定(用保留时间表示)；其他方法有96孔板结合紫外吸收测定的方法。
3. 解离度
化合物的解离度可以帮助了解在不同pH情况下化合物的解离程度，当pH＝pKa时，化合物一半处于解离状态，一般处于中性状态。胃肠道和生物内环境均处于不同的pH状态，影响着药物的解离状态，从而对药物的溶解度、亲脂性产生影响，进一步影响到药物的吸收及与蛋白结合。以往常规的测定pKa的方法是采用电位滴定法，该法通量较低、需要的样品量大，一天仅可测定10个化合物，其他方法有毛细管电泳法，该法需要的样品量很少，但通量也仅为每天10个化合物。高通量的方法主要为光谱梯度分析法(spectral gradient analysis，SGA)，可以使用96孔板，一天的通量可以达到240个化合物。
为了确定药物之间存在的相互作用潜力，制药界主要按照下述方法进行实验。

（四）药物相互作用研究

药物因药代动力学方面所引起的相互作用而收回的例子已经有多个，而出现这种情况主要有两种机制：酶抑制和酶诱导。
1. 代谢酶的确定
找出负责药物体内代谢的关键酶，评价待测药物与抑制剂或诱导剂之间的相互作用潜力。例如，如果一个药物主要由CPY3A4代谢，则这个药物可能与CYP3A4抑制剂如酮康唑、红霉素、伊曲康唑或诱导剂如利福平、苯妥英之间产生药物相互作用。在进行药物相互作用潜力研究时，可以使用提取的肝微粒体、重组表达的肝微粒体、肝细胞。通过重组表达的肝微粒体可以进行药物代谢酶的确定；肝微粒体和某一P450同工酶抑制剂合用也可以用于推测药物代谢酶；人类肝细胞和抑制剂合用可以用于药物代谢途径的确定，因为肝细胞除Ⅰ相代谢酶外还包括Ⅱ相代谢酶。
2. 评价候选化合物对关键的药物代谢酶的抑制潜力
如果一个化合物是药物代谢酶的抑制剂，则可以与该酶的药物底物产生药物相互作用。研究时使用肝微粒体和特殊的底物就可以进行酶抑制潜力的研究，根据计算得到的IC50或Ki值，判断药物相互作用潜力。也可以使用重组表达的肝微粒体以及肝细胞进行研究。本项研究可以采用高通量的方式进行。
3. 诱导潜力
一个药物如果可以诱导肝细胞过度表达某个代谢酶，则这个药物可以与这个药物代谢酶的底物产生药物相互作用。本项研究只能使用活的原代肝细胞才能进行，实验需要持续2-4天，该种方法属于低通量方法。另外一种方法是使用XPR-reporter细胞系进行研究，可以提高研究的通量。已知XPR是CYP3A4诱导剂的受体，药物与XRP结合会导致相连的reporter基因活化，从而提示该药物是CYP3A4的诱导剂。
另外，需要关注的是药物转运蛋白所引起的药物相互作用；还应对抑制的机制进行分析，区分是否是竞争性酶抑制还是机制依赖性酶抑制。据报道，机制依赖性酶抑制引起的药物相互作用的几率更高。另外，Ⅱ相代谢酶的抑制作用也需要关注。

三、体内方法

在药物发现阶段，动物体内研究从给药剂量、采血点、动物数量方面与药物开发阶段的体内研究区别很大。这个阶段，体内研究的目的主要是用于先导化合物的优化，结合体外研究结果对候选化合物的进一步研究提出建议。体内研究是一种低通量、耗时、所需样品量大、不经济的研究方法，但体内研究拥有体外研究所没有的血流、各种因子等影响因素，是新药研究中不可缺少的一项。在体内研究中，为提高通量一般采取两种方法：提高分析速度和减少样品数量。

（一）提高样品分析速度

在体内研究中，有大量的样品需要测定。提高测试速度是提高通量的最常用的方法。样品分析一般为HPLC方法和LC-MS/MS方法。由于待分析的化合物结构各异，因此，所建方法需要一定的灵敏度和专属性。HPLC因方法建立时间长、样品处理步骤多，不能瞒足高通量测试要求。LC-MS/MS由于具有灵敏度高、专属性好、样品处理简单(生物样品进行蛋白沉淀即可)的特点在样品分析中使用得越来越多。该法的缺点是基质效应的影响。另一个提高测试速度的方法是采用在线(on line)固相萃取(SPE)方法，自动进行样品处理，该方法的缺点是方法建立仍然繁琐、分析时间长。
还有一种提高通量的方法是进行浊度流动分析(turbulent flow)色谱，可以使用血清、尿样品，不加处理直接进行分析。其他提高分析速度的方法如使用MUXTM系统的平行LC-MS/MS分析。一般可以使用4根色谱柱，每根色谱柱的流出物被依次引入到MS/MS的离子化室内。与使用1根色谱柱的LC-MS/MS相比，这种方法的分析速度可以提高近4倍。在色谱柱方面，缩短分析时间可以采用细粒填料的短的色谱柱。使用这种色谱柱的液相色谱称为阴分离液相色谱。如使用细粒短柱(2.1mm×20mm，3 μm或更细填料)、通用快速梯度(有机相在2分钟内由5％到95％，流动性中含有0.035％～0.05％三氟乙酸或0.1％甲酸或10 mmol/L乙酸铵)、高流速(1-5 ml/min)等，这些操作可以使每个样品分析时间仅为30s。

（二）减少样品数量

在体内研究中，减少样品的数量可以通过盒式给药(cassette dosing)的方法，将几种药物合用，一次取样就可以通过LC-MS/MS将几个药物的浓度同时测定出，该种方法的最大争议是可能存在的药物相互作用；另一种方法是将数个含有不同药物的样品混合后一同测定，也可以将给药后不同时间点的血样等量混合来粗略估计药物在体内的AUC。
需要强调的是应建立与测定速度配套的数据处理系统。通过使用不同的软件，使获得的数据能够生成易于被决策者辨认的报告。