非临床药代动力学/临床前药代动力学

非临床药代动力学研究是通过动物体内、外和人体外的研究方法，揭示药物在体内的动态变化规律，获得药物的基本药代动力学参数，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄的过程和特点。非临床药代动力学研究的主要内容包括血药浓度-时间曲线测定、吸收、分布、排泄、血浆蛋白结合、生物转化、对药物代谢酶活性的影响等。

一、实验动物的选择及试验方法

（一）实验动物

非临床药代动力学研究最好选择遗传背景清楚、体内代谢过程与人相似的动物。幼年、高龄、孕期、疾病模型动物可用于研究不同年龄、生理、病理状态下的药代动力学规律，无特殊要求时一般选择成年、健康动物。对于特定性别用药或性别差异对药代动力学有影响的药物，可在特定性别或分别在两种性别的动物中进行试验。对于经胃肠道给药的药物，一般应在给药前禁食12h，并在试验中注意根据具体情况统一给药后禁食时间，以避免由此带来的数据波动及食物的影响。经口给药时不宜选用兔等食草动物。

（二）实验方法

非临床药代动力学研究的一般方法是按临床拟用的给药途径，给予动物一定剂量的某受试物，测定其体液(血、尿、胆汁、粪便、组织、乳汁、唾液、脑脊液、房水等)中药物浓度随时间的变化情况，从而了解受试物在动物体内的药代动力学特征。由于药代动力学已经参与到新药研发中药物的发现阶段，发展高通量的药代筛选技术开始受到普遍重视。目前这项工作主要是利用体外和体内两种手段开展研究。
体外研究手段主要是围绕胃肠道吸收特性、代谢速率和程度，以及与代谢酶相关的药物相互作用等进行。

常用的体外模型和方法有：

  用从人结肠癌组织培养出的Caco-2细胞株或犬肾来源的MDCK细胞评价药物的吸收特性；

  用动物的肠组织建立组织流通池模型和外翻肠模型来评价药物的肠吸收特性；

  用肝细胞或肝微粒体作为酶源，通过酶动力学法或多时间点法评价药物的代谢特点；

  应用肝切片、肝细胞、亚细胞组分及cDNA重组的CYPs等酶源对药物进行P450酶抑制筛选。体外筛选模型具有速度快、成本低的特点，但试验结果与体内真实情况存在相关性的问题，并且无法获得一些重要的药代参数。

为了增加药代动力学筛选通量，还可以对动物体内试验方案进行合理的简化，减少所需分析的生物样品数量。目前主要有以下两种方案：盒式给药方案和样品混合方案。

盒式给药方案是由BermanJ等于1997年提出的。将n个化合物做成混合的给药溶液给动物用药，在不同时间点收集血样，建立这n个化合物同时分析的方法，同时检测这些化合物在体内的浓度，从而可以同时得到这些化合物的药代动力学参数。将这种方案用于药代筛选可以减少需要分析的生物样品数量，减少实验动物用量，利用同一只动物比较多个化合物的药代特征。但盒式给药方案也有明显的局限性：首先，要找到合适的溶媒，保证这些化合物能同时给药；其次，要建立多个化合物同时检测的分析方法，增加了分析方法建立和验证的难度；此外，化合物之间可能存在相互作用，从而影响试验结果的准确性。

样品混合方案比较多用的有两种方式：

  ①等时间点混合法。将不同的化合物给予不同动物，在给药后相同时间点收集这些动物的血样，并把不同化合物在相同时间点的血样混合，同时检测这些化合物的血药浓度。这一方法的主要优点是对于不同的化合物可以采用不同的给药剂型，对给药剂量也不需要像盒式给药那样考虑得很多，可以减少需要分析的样品数量，避免药物相互作用对试验结果的影响。当然由于生物样品在分析前进行混合，对分析方法的灵敏度提出了更高的要求，动物实验的工作量也高于盒式给药。

  ②同只动物样品混合法。不同的化合物给予不同动物后，在等时间段的固定时间点收集血样，并把同只动物的样品等体积混合，通过测定混合后样品的浓度进行药代筛选。这种方法可以快速得到化合物给药后在体内的药—时曲线下面积，从而可以把所研究的化合物按生物利用度的高低进行排序。但这个方法不能得到完整的药-时曲线，因而得不到一些重要的药代参数，如Tmax、Cmax等。所以这种方法比较适合于早期的药物发现阶段，可筛选具有合适的口服生物利用度的化合物。

由于在吸收、分布、代谢和排泄方面与人非常相似的动物种属几乎是不存在的，目前从动物研究结果准确预测药物在人体的所有药代动力学特征是不可能的。然而，在某些合理定义的前提下，作出一些合理的预测是可能的。例如，某药物通过胃肠道的吸收特征在种属间可能是相似的，因为上皮细胞的性质在哺乳动物之间是相似的，并且吸收过程主要取决于药物和生物膜之间的相互作用。然而pH依赖的溶解性、首关效应等影响吸收的限速步骤和因素在种属之间存在差异，从而导致吸收的种属差异。应用人和动物的肾小球滤过率比率来预测药物在人体的肾排泄也是相对成功的，同样，如果某药物主要通过肝消除，其消除速率受肝血流速度所限，则可用肝血流速度来预测药物在人体的清除率。然而蛋白结合和药物的代谢转化等参数仅有很小的可预测性，这些参数在种属之间显著变化。在结合非临床药效学和毒理研究结果预测药物在人体的有效性和安全性时，血药浓度和药-时曲线下面积是相关性最好的指标。

二、动物药代动力学研究设计

动物药代动力学研究是创新药物研究的一个重要方面，其研究结果对新药的后续研究有着重要的指导意义，因此，其实验设计、样品测定及结果处理都必须遵循科学合理的指导原则。下面从实验动物的选择、给药剂量/方式的选择、样品的采集、样品测定及结果处理几个方面来进行阐述。

（一）实验动物的选择

药代动力学研究常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、猴、小型猪等。可根据研究的需要和受试物的作用特点、研究目的、药物浓度测定方法、样本的种类和数量等选择适宜的动物，并尽可能与药效学和毒理学研究所用的动物一致。小动物的生理参数、肝和肾的脏器指数高于大动物，体循环速度也快于大动物，因此进行血药浓度测定时一般首选非啮齿类的大动物，而组织分布和排泄研究一般可采用操作方便的小鼠、大鼠。
以每个采样点不少于5个数据为限计算所需动物数。最好从同一动物个体多次取样，尽量避免多只动物的合并样本。如受其他因素制约，一只动物不能满足多次取样需要，由多只动物的数据共同构成一条血药浓度—时间曲线时，应相应增加动物数，以反映个体差异对试验结果的影响。

（二）给药剂量及给药途径

血药浓度测定一般在有效剂量到安全剂量范围内至少选择3个剂量，其高剂量最好接近最大耐受剂量，中、低剂量根据动物有效剂量的上下限范围选取，避免剂量过于集中。主要考察在所测试的剂量范围内，药物的体内动力学过程是属于线性还是非线性，以利于解释药效学和毒理学研究中的发现，并为新药的进一步开发和研究提供信息。分布和排泄研究一般选择一个有效剂量进行试验。
药物经不同途径给药时，其体内动力学过程不同，为了更好地提示药物在人体内的情况，动物药代动力学研究所用的给药途径和方式，应尽可能与临床拟用方案一致。

（三）样品采集

采样点的确定对药代动力学研究结果有重大影响，若采样点过少或选择不当，得到的结果可能与药物在体内的真实情况产生较大差异。

1. 血样采集

给药前需要采血作为空白样品。为获得给药后的一个完整的血药浓度—时间曲线，采样时间点的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相(峰浓度附近)和消除相。一般在吸收相至少需要2~3个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度(Cmax)；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除相需要4~6个采样点。整个采样时间至少应持续3~5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。为保证最佳采样点，在正式试验前，选择2~3只动物进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原设计的采样点。

2. 组织样本采集

参考血药浓度-时间曲线的变化趋势，选择至少3个时间点分别代表吸收相、平衡相和消除相，采集心、肝、脾、肺、肾、胃肠道、生殖腺、脑、体脂、骨骼肌等组织样本进行药物浓度测定。采集时注意样本的一致性和均一性，即每只动物尽可能在同一部位取样，以避免药物在不同部位分布差异造成的误差。较大的脏器如肝可在预试验时多点取样，以了解药物在整个脏器的分布情况，避免误差。取样后的组织先经仔细修理，去掉脂肪、黏膜等外围组织，精确称重后进行粉碎、匀浆等处理。

3. 尿样和粪样采集

将动物放入代谢笼内，选定一个有效剂量给药后，按一定的时间间隔分段收集尿或粪的全部样品。粪样晾干后称重(不同动物粪便干湿不同)，按一定比例制成匀浆，记录总体积，取部分样品进行药物含量测定。
应采集给药前尿及粪样，并参考预试验的结果，设计给药后收集样品的时间点，包括药物从尿或粪中开始排泄、排泄高峰及排泄基本结束的全过程。

4. 胆汁收集

一般用大鼠在乙醚麻醉下作胆管插管引流，待动物清醒后给药，并以合适的时间间隔分段收集胆汁，进行药物测定。

（四）样品测试

药代动力学研究中测试的生物样品较常见的有血、尿、胆汁、粪便、组织、乳汁、唾液、脑脊液、房水等。生物样品的测试方法包括色谱法、放射性核素标记法、免疫学和微生物学方法。应根据受试物的性质，选择特异性好、灵敏度高的测定方法。色谱法包括高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、气相色谱法(gas chromatograph，GC)和液相/气相色谱liquid / gas chromatograph，LC/GC)与质谱(mass spectrum，MS)联用的方法(如LC-MS，LC-MS/MS，GC-MS，GC-MS/MS等)。在需要同时测定生物样品中多个化合物的情况下，LC-MS/MS和GC-MS/MS联用法在特异性、灵敏度和分析速度方面有更多的优点。

对于前体药物或有活性(药效学活性或毒理学活性)代谢物的药物，建立方法时应考虑能同时测定原型药和代谢物，以考察物料平衡，阐明药物在体内的转归。在这方面，放射性核素标记法和色谱-质谱联用法具有明显优点。

应用放射性核素标记法测定血药浓度可配合色谱法，以保证良好的检测特异性。如某些药物难以采用上述的检测方法，则可选用免疫学或生物学方法，但要保证其可靠性。

放射免疫法和酶标免疫法具有一定特异性，灵敏度较高，但原型药与其代谢物或内源性物质常有交叉反应，需提供证据说明其特异性。

生物学方法(如微生物法)常能反映药效学本质，但一般特异性较差，应尽可能用特异性高的方法(如色谱法)进行平行检测。

生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础，所有药代动力学研究结果都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果。通过准确度、精密度、特异性、灵敏度、重现性、稳定性等研究建立了测定方法，得到标准曲线后，在检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。

（五）数据处理

动物药代动力学研究的内容多，所得的各种数据量大，试验后需汇总的数据如下：

1. 血药浓度和药-时曲线

记录各个动物在每个时间点的血药浓度，分别绘制血药浓度-时间曲线；计算各剂量组动物在每个时间点血药浓度的平均值及标准差，分别绘制各剂量组的血药浓度-时间曲线。多次给药时，还需提供各个(和各组)受试动物的3次稳态谷浓度数据、血药浓度达稳态后末次给药的血药浓度-时间数据和曲线。

2. 药代动力学参数

根据试验中测得的各受试动物的血药浓度-时间数据，采用药代动力学专用的计算机程序求得受试物的主要药代动力学参数，如Cmax(峰浓度)、Tmax(达峰时间)、T1/2(消除半衰期)、Vd(表观分布容积)、AUC(血药浓度-时间曲线下面积)和CL(清除率)等。其中，Cmax、Tmax采用实测值，AUC采用梯形法计算可以更客观地反映药物在体内的实际情况。另外，统计矩参数如MRT(平均滞留时间)和AUC(0-∞)等，对于描述药物药代动力学特征也是有意义的。

3. 组织分布数据

记录各组织/脏器吸收相、平衡相和消除相时间点的药物浓度数据；分别绘制各剂量组、各组织/脏器的血药浓度-时间曲线；以柱形图等形式汇总和比较各组织/脏器的药物分布情况，分析药物分布的规律和特点。

4. 排泄数据

记录各时间段收集的尿、粪、胆汁等排泄物中的药物浓度和样品体积或重量，计算每个时间段的药物排出量、累积量、总排出量及经各排泄途径排出的药物占总给药量的比例。

5. 血浆蛋白结合率

测定动物和人在不同药物浓度下的血浆蛋白结合率。

6. 代谢数据

记录血浆及各种排泄物中主要代谢物的种类和含量，分析药物在体内生物转化的类型、主要转化途径及可能涉及的代谢酶。药物对药物代谢酶，特别是细胞色素P450同工酶的诱导或抑制作用。

有效整合各项试验数据，选择科学合理的数据处理及统计方法。如用计算机处理数据，应注明所用程序的名称、版本和来源，并对其可靠性进行确认。

对所获取的数据进行科学和全面的分析与评价，综合论述药物在动物体内的药代动力学特点，包括药物吸收、分布和消除的特点；经尿、粪和胆汁的排泄情况；与血浆蛋白结合的程度；药物在体内蓄积的程度及主要蓄积的器官或组织；阐明药物在体内的生物转化、消除过程及物质平衡情况。分析药代动力学特点与药物的制剂选择、有效性和安全性的关系，为药物的整体评价和临床研究提供更多有价值的信息。

（六）非临床药代动力学研究在药物开发阶段的应用

非临床药代动力学研究在药物发现、药理及毒理研究、临床试验等阶段均有所体现。

首先，在新药筛选和设计的初期，得到了一系列候选化合物之后，除了要通过简单的药效学试验考察其药效活性外，还要考虑药代动力学方面的因素。例如，是否容易转运到药效作用部位(如中枢神经系统用药应能通过血脑屏障)、是否有合适的半衰期、口服吸收是否良好(以便选择合适的给药途径)等。代谢途径是否复杂也会成为决定是否进一步开发的考虑因素，因为代谢途径复杂的药物将增加不同种属及不同人群间的药效与毒性的不可预测性，给进一步的开发带来困难和风险。不同的取代基团可能引起不同的生物转化，可以通过定向结构改造来改变药物的药代动力学特征，使其更有利于临床应用。因此在新药筛选当中可选择一些有可能成为候选药物的代表性化合物，用少量动物或体外试验系统(Caco-2细胞模型、体外肝系统等)进行部分药代动力学研究，以初步考察其吸收、代谢情况。

动物体内药代动力学研究是药理和毒理研究的重要组成部分，也是非临床药代动力学研究的主体，在临床前提供了最大量的药代信息，来支持对新药的评价和进一步开发。

对于创新药物，临床前要进行代谢方面的研究，特别是作为前药的药物，由于在体内产生药效和毒性的是其活性代谢物，临床前需要对其活性代谢物的结构、数量、代谢途径等进行深入细致的研究。但对于以代谢消除为主的药物，其代谢的目的仅仅是消除，代谢物不具有生物活性，考虑到代谢研究的复杂和艰巨，部分研究(如代谢物的定量)可在临床试验期间完成。对代谢酶的影响、药物相互作用等研究，根据药物的具体情况，有些研究可在临床试验前完成，有些也可在临床试验期间完成，并且需要结合临床研究的一些结果进行试验设计和综合评价。例如在人体药代动力学研究中若发现有明显的种族差异，或与动物研究结果有种属差异，可能需要返回来进行代谢途径和代谢酶的研究，为临床试验结果提供合理的解释；如果在Ⅲ、Ⅳ期临床试验中发现所开发的品种与联合使用的其他药物有相互作用，可能需要返回来考察药物对代谢酶的诱导或抑制作用、药物与蛋白结合的竞争或抑制等。另外，通过代谢研究，可提示代谢的种属差异，为合理选择安全性评价的动物提供依据，若发现人体内可能产生动物没有的主要代谢物，则需要进行该代谢物的安全性评价。

非临床药代动力学研究在新药的研发与评价中起着重要的桥梁作用。非临床药代动力学与药物化学、药剂学、药效学、毒理学和临床研究是密切联系的，通过这些联系，把这些分支学科结合在一起，形成新药研发与评价的大学科。

非临床药代动力学研究是药剂学研究的主要依据和工具之一，进行剂型选择时也要考虑药代因素，如口服吸收不好、首关效应明显的药物不适合做成口服制剂。可以通过药代比较研究(生物利用度或生物等效性)来考察制剂处方和工艺的合理性，例如可通过局部吸收研究考察用于皮肤给药的制剂处方中促渗透剂含量的合理性；通过动物体内药代动力学比较研究(与常释制剂或已上市缓释制剂比较)来初步考察缓释制剂处方工艺的可行性等。另一方面，剂型特征、具体制剂所使用的辅料、制备工艺等也是影响药代的重要因素，因此也可以通过药剂学手段改变药物的某些药代性质，使其更符合临床用药的需求。

在药效学方面，非临床药代动力学研究可提供药物浓度与药效的关系；说明药效反应的种属差异在药代方面的原因；提供药物分布与药效的关系；解释不同给药途径与药效的关系。

在毒理学方面，非临床药代动力学研究可提供药物浓度与毒性反应的关系(毒代动力学研究范畴)；提示可能的毒性靶器官，例如在组织分布研究中发现骨髓蓄积，则应考虑骨髓可能是毒性靶器官，在后续毒理试验中要相应增加对造血功能、血细胞形态学的考察指标；代谢物研究可能提示毒性作用机制，例如大剂量对乙酰氨基酚可导致肝坏死，代谢研究发现对乙酰氨基酚的主要代谢物是羟基化产物，该羟基化产物与谷胱甘肽结合而解毒，但在过量的情况下，剩余的羟基化产物还会与肝细胞内的酶和调节蛋白结合，从而导致肝损伤。
非临床药代动力学研究得到的药代动力学参数(如半衰期)、代谢信息(代谢途径、产物、酶等)可为设计和优化临床给药方案提供有关依据。