急性毒性试验常用方法及试验设计原理综述

急性毒性试验/重复给药筛选试验

急性毒性评价是体内安全性评价的基本类型之一，药品注册通常需要开展急性毒性评价。急性毒性试验所得数据在安全性评价中具有重要作用，可在初步毒性特征描述中用于确定最大耐受剂量（MTD）或最小致死剂量（MFD）。这些数据还可为安全药理学试验及重复给药毒性试验的剂量选择提供依据。

此外，急性毒性试验可用于早期候选药物的筛选，亦可与简单的重复给药毒性筛选试验联合开展。需要注意的是，只有在获得与给药途径和临床适应症相关的生物利用度及系统暴露数据的前提下，急性毒性研究结果才能提供更具价值的安全性信息。

（一）急性毒性（重复给药筛选试验）

急性毒性试验可采用多种研究形式，但其主要目的基本一致，即评估候选药物在临床预期剂量若干倍水平下的耐受性。筛选试验的优势在于可在同一研究中同时比较多个候选化合物。耐受性指标（如体重变化、饲料消耗量变化及异常临床症状等）可为判断候选药物的相对安全性提供参考依据。

在此类研究中，动物品种的选择通常不要求覆盖所有动物种属，但至少应评价一种啮齿类动物。对于拟长期每日给药的药物，在5～7天的暴露周期内开展重复给药耐受性评价也是可行的，这有助于初步评估临床病理学终点的潜在变化，并为后续毒性试验的剂量设计提供参考。但该类筛选试验不能替代用于注册申报的正式急性毒性试验。

（二）急性毒性试验的基本设计

急性毒性试验通常设置每组动物数量相对较少的多个剂量组。对于啮齿类动物研究，每个剂量组每个性别设置5只动物一般已足够；第二种动物品种通常每组使用2～3只动物。试验中应设置溶媒对照组，并至少设置3个供试品剂量组；在对供试品毒理学特性了解有限的情况下，可适当增加剂量组数量。

在单次给予供试品后，应对动物的体重、饲料消耗量及临床症状进行系统观察，以获取毒理学作用的关键信息。在规定观察期结束后（通常为给药后第14天），对存活动物实施安乐死并进行大体解剖检查，重点评估组织和器官的肉眼可见病变。一般情况下，不再对上述组织进行进一步的组织病理学检查。

急性毒性评价通常侧重于明显毒性反应的观察，包括体重变化、饲料消耗减少、死亡或濒死表现，以及与供试品相关的药理学作用等临床指标。急性毒性试验结果可为后续重复给药毒性试验的剂量设计提供重要参考。

急性毒性试验服务项目：

考察受试药物在小鼠中的半数致死量（LD₅₀）或最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，MTD）。
半数致死量（Median Lethal Dose，LD₅₀）：在一定试验条件下，可引起 50% 的受试动物死亡的剂量，该数值通过统计学方法计算获得。
最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，MTD）：在既定试验条件下，不引起受试动物死亡且未出现明显不可接受毒性反应的最高给药剂量。

服务内容：

1、开展小鼠急性毒性预试验，用于确定合理的剂量设计；
2、 根据受试药物的理化性质和作用特点，选择合适的给药途径，包括灌胃、静脉注射、腹腔注射和皮下注射等；
3、 对出现异常表现的动物进行必要的病理组织学检查。

一、概述

动物急性毒性试验（Acute toxicity test，Single dose toxicity test）

是指研究动物在一次给药或在 24 小时内多次给予受试物后，于一定观察期内所产生的毒性反应。拟用于人体的药物通常需要开展动物急性毒性试验。

急性毒性试验处于药物毒理学研究的早期阶段，对于阐明药物的毒性作用特征及识别潜在毒性靶器官具有重要意义。急性毒性试验所获得的信息可为长期毒性试验的剂量设计以及部分药物Ⅰ期临床试验起始剂量的选择提供重要参考，并可提供与人类药物过量所致急性中毒相关的基础信息。

急性毒性试验的设计应在充分了解受试物相关信息的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据化合物的结构特点、理化性质、适应症特征及试验目的等因素，选择合理的试验方法，制定适宜的试验方案，并结合其他药理学和毒理学研究结果，对试验数据进行全面评价。

急性毒性试验应遵循一般动物试验的基本原则，即随机、对照和可重复性。

二、基本概念

最大无毒性反应剂量（未见不良反应剂量，No Observed Adverse Effect Level，NOAEL）：

指受试物在一定时间内以特定方式给予机体，在采用灵敏的检测方法和观察指标的条件下，未观察到任何不良反应的最高剂量。

最小毒性反应剂量：

动物出现毒性反应的最小剂量。

最大耐受剂量（Maximum Tolerated Dose，MTD）：

指在规定试验条件下，动物可耐受且未出现死亡或不可接受毒性反应的最高给药剂量。

最小致死剂量（Minimal Lethal Dose，MLD）：

指在一定试验条件下，引起个别受试动物死亡的最低剂量。

半数致死量（Median Lethal Dose，LD₅₀）：

指在一定试验条件下，引起 50% 的受试动物死亡的剂量，该数值通过统计学方法计算获得。

三、研究内容

（一）受试物

急性毒性试验所用受试物应为制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准要求的样品。应明确注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等信息，并附研制单位出具的自检报告。所用辅料、溶媒等亦应注明其批号、规格和生产厂家，并符合试验相关要求。

（二）动物

1.种属：
不同种属动物具有各自的生理特点，对同一药物的毒性反应可能存在差异。啮齿类动物与非啮齿类动物急性毒性试验所得结果在毒性表现的性质和程度上均可能不同。为充分表征受试物的毒性特征，应从啮齿类动物和非啮齿类动物中获得较为全面的安全性信息。因此，急性毒性试验原则上应采用至少两种哺乳动物，一般选用一种啮齿类动物和一种非啮齿类动物。如未采用非啮齿类动物，应对其合理性作出说明。

2.性别：
通常应采用两种性别的试验动物，雌雄各半；如仅采用单一性别动物进行试验，应阐明其科学依据和合理性

3.年龄：
通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于儿童或可能用于儿童，建议必要时采用幼年动物进行试验。

4.动物数：
试验动物数量应根据动物种属和研究目的合理确定，并满足试验方法及结果分析评价的需要。在保证获得充分信息的前提下，应尽量减少动物使用数量

5.体重：
试验动物的初始体重不应超过或低于平均体重的 20%。

可根据试验目的及受试物特点，综合确定试验动物的性别、年龄等条件。所有试验动物均应符合国家有关实验动物等级要求，来源、品系及遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证明。

（三）给药途径

不同给药途径会影响受试物的吸收速度、吸收率及系统暴露水平，因此急性毒性试验可采用不同的给药途径。通过比较不同给药途径下的毒性结果，还可获得初步的生物利用度相关信息。

一般情况下，给药途径应至少包括临床拟用途径以及一种能够使原形药物较完全进入体循环的途径（如静脉注射）。若临床拟用途径本身为静脉给药，则仅采用该途径即可。

经口给药前，动物通常需禁食一段时间（一般为一夜），但不禁水。由于胃内容物可能影响给药容量，而禁食时间的长短亦可能影响啮齿类动物药物代谢酶活性及肠道吸收，从而影响毒性暴露水平。

（四）给药剂量水平

急性毒性试验的重点在于观察动物的毒性反应表现。可根据研究目的选择适当的方法开展急性毒性研究。对于非啮齿类动物，给药剂量达到出现明显毒性反应即可，通常无须达到致死水平。

总体而言，给药剂量应覆盖从未见毒性反应剂量至出现严重（危及生命）毒性反应的剂量范围，并设置空白对照组和/或溶媒（辅料）对照组。不同动物种属及给药途径下的最大给药容量可参考相关文献并结合实际情况确定。

（五）观察时间及指标

给药后，一般连续观察至少14天，观察的间隔和频率应合理设置，以便能观察到毒性反应出现的时间及其恢复时间、动物死亡时间等。观察的指标包括一般指标（如动物外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、动物死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、动物体重变化（给药前及试验结束处死前至少各称重一次，观察期间可适当增加称重次数）等。记录所有的死亡情况、出现的症状，以及症状起始的时间、严重程度、持续时间等。

（六）病理学检查

所有的试验动物均应进行大体解剖，包括试验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及试验结束时仍存活的动物。凡发现组织或器官在体积、颜色或质地等方面出现异常改变，均应予以记录，并进一步进行组织病理学检查。

四、数据分析及评价

（一）结果处理和分析

1.根据所观察到的各种反应出现的时间、严重程度、持续时间等，分析各种反应在不同剂量水平下的发生率、严重程度。根据观察结果归纳分析，判断每种反应的剂量－反应关系和时间－反应关系。
2.结合临床观察结果，判断已出现的毒性反应可能涉及的组织、器官或系统。
3.根据大体解剖中观察到的肉眼可见病变及组织病理学检查结果，初步判定可能的毒性靶器官。组织病理学检查应形成规范的病理学报告，并由病理学检查负责人签名，同时加盖药品注册申请人公章；对存在病变的组织应提供相应的病理学照片。
4.综合不同剂量组的毒性反应类型、发生率及动物死亡情况，确定动物对受试物的未见毒性反应剂量和严重毒性反应剂量。为此，可采用适当的试验和评价方法，测定最大无毒性反应剂量或最小毒性反应剂量，以及最大耐受剂量、近似致死剂量或最小致死剂量等，以初步界定受试物的安全范围。
5. 对于需要测定LD50的药物，应采用合理的统计学方法对其进行求算。
6. 说明所使用的计算方法和统计学方法，并提供所选方法合理性的依据。

（二）综合评价

综合考虑不同剂量水平下毒性反应的出现时间、发生率、剂量–反应关系，以及不同动物种属、实验室历史对照数据、病理学检查结果和同类药物的毒性特征，判断观察到的毒性反应与受试物之间的相关性。
在此基础上，总结受试物的安全范围、毒性反应的严重程度及其可逆性；并结合毒性可能涉及的部位，综合大体解剖和组织病理学检查结果，初步判定其毒性作用靶器官。
急性毒性试验结果可为后续毒理学研究的剂量选择提供依据，并提示后续研究中需重点关注的毒性指标。此外，通过比较不同给药途径下动物的反应情况，可对受试物的生物利用度作出初步判断，为剂型开发提供参考。

五、急性毒性试验常用试验方法

由于受试物的化学结构和活性成分含量不同，其毒性反应的类型和强度亦存在差异。因此，研究者应根据受试物的特点，选择以下试验方法，或采用国内外公认的其他急性毒性试验方法。

1. 近似致死剂量法

该方法主要用于非啮齿类动物的急性毒性试验，试验方法如下：

一般采用6 只健康的Beagle 犬或猴。犬的年龄一般为4-6 月龄，猴的年龄一般为2-3 岁，如选用其他动物种属，应说明其科学依据和合理性。

根据小动物毒性试验结果、受试物的化学结构及其他相关资料，估计可能引起毒性反应和死亡的剂量范围，并按 50% 递增原则设计包含多个剂量水平的剂量序列表。

根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给予一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，随后，选取两者之间的中间剂量再给予 1 只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围可作为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围可作为近似致死剂量范围。

2. 最大给药量法

对于某些毒性较低的受试物，可采用最大给药量法进行急性毒性评价。在合理确定最大给药浓度和给药容量的前提下，以允许的最大剂量进行单次给药，或在 24 小时内多次给药（总剂量一般不超过 5 g/kg 体重），观察动物出现的毒性反应。

该方法通常使用 10～20 只试验动物，给药后连续观察不少于 14 天。

3. 固定剂量法（Fixed-dose procedure）

固定剂量法最初于 1984 年由英国毒理学会提出。该方法不以动物死亡作为主要观察终点，而是以明确且可观察到的毒性体征作为评价依据。

试验通常选择 5、50、500 和 2000 mg/kg 四个固定剂量进行研究；在特殊情况下，可增加 5000 mg/kg 剂量。试验动物首选大鼠。给药前禁食 6～12 小时，给药后继续禁食 3～4 小时。试验采用一次给药方式进行。若无资料表明雄性动物对受试物更为敏感，预试应首先采用雌性动物。

根据受试物的相关资料，从上述四个剂量中选择一个作为初始剂量；如缺乏可供参考的资料，可选用500mg/kg作为初始剂量进行预试。若该剂量未出现毒性反应，则可采用 2000 mg/kg 进行预试；如在该剂量下未观察到动物死亡，可终止预试。若初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量进行试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察7天。

在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但不导致死亡的剂量用于正式试验；如预试结果表明，5.0mg/kg 即可引起动物死亡，则应降低一个剂量档次进行正式试验。

给药后观察期不少于 2 周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每只动物均应仔细观察并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。给药当天至少应观察记录两次，以后可每天一次。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。动物死亡时间的记录要准确。

给予受试物前、后各1周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应作组织病理学检查。固定剂量法试验结果应参照相应评价标准进行判定。

4. 上下法（阶梯法，序贯法，Up and down method）

该方法由Dixon和Mood首次提出，1985年Bruce对其进行了改进，目前是OECD和EPA推荐的急性毒性试验方法之一。该方法的主要特点是可显著减少试验动物的使用数量，同时不仅能够观察毒性表现，还可估算 LD₅₀ 及其置信区间，适用于可能引起试验动物快速死亡的受试物。

上下法包括限度试验和主试验两部分。限度试验主要用于已有资料提示受试物毒性可能较低的情况，相关毒性信息可来源于与受试物相关的化合物、类似混合物或产品。当相关毒性资料较少或缺乏，或预期受试物具有明显毒性时，应直接开展主试验。

限度试验：是一种最多用5 只动物进行的序列试验。常用试验剂量为2000 mg/kg，在特殊情况下也可使用5000 mg/kg。

2000 mg/kg剂量水平的限度试验: 将受试物给予1 只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，依次将受试物给予另外4只动物，动物总数为5只。

如果1 只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价: 有3 只或3 只以上动物死亡时，LD50小于2000mg/kg；有3只或3只以上动物存活时，LD50大于2000 mg/kg；如果有3 只动物死亡，则进行主试验。

5000mg/kg剂量水平的限度试验:特殊情况下，可考虑使用5000mg/kg的剂量。将受试物给予1只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，将受试物给予另外2只动物。如果这2只动物都存活，则LD50大于5000mg/kg，停止试验（即不再对其他动物给药，观察14天）。如果这2只动物中有1只死亡或者2只均死亡，将受试物给予另外2只动物，一次1只。如果1只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价。有3只或3 只以上动物死亡时，LD50小于5000 mg/kg；有3 只或3 只以上动物存活时，LD50大于5000 mg/kg。

主试验:由一个设定的给药程序组成，在此程序中，每次给药1只动物，间隔至少48小时。给药间隔取决于毒性出现时间、持续时间和毒性的严重程度。在确信前一只动物给药后能存活之前，应推迟按下一剂量给药。时间间隔可以适当调整，但使用单一时间间隔时，试验会更简便。

第一只动物的给药剂量低于LD50的最接近的估计值。如果该动物存活，第二只动物给予高一级剂量；如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。剂量级数因子应选定为1/（剂量-反应曲线斜率估计值）的反对数（对应于斜率2的级数因子为3.2），并应在整个试验过程中保持不变。当没有受试物的斜率的有关资料时，使用3.2为剂量级数因子。

使用默认级数因子时，剂量应从以下序列中选择：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000mg/kg（或有特殊要求时1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000mg/kg）。如果没有受试物的致死估计值，应该从175mg/kg开始。如果预期动物对该受试物的耐受程度变化很大（即，估计斜率小于2.0），那么开始试验前应考虑增加剂量级数因子超过按对数剂量计算的默认值0.5（即，级数因子为3.2）。同样，对于已知斜率很陡的受试物，应选择小于默认值的级数因子。

在决定是否及如何对下一只动物给药之前，每只动物都应认真观察达48小时。当满足停止试验标准之一时，停止给药，同时根据终止时所有动物的状态计算LD50估计值和可信区间。 用最大可能性法计算LD50值 (美国EPA开发了相应的计算软件，AOT425StatPgm)。

当满足下列停止试验标准之一时，停止试验：

（a） 连续3 只动物存活；

（b） 任意连续6 只试验动物，有 5 次连续发生存活/死亡状态转换；

（c） 第一只动物发生转换之后至少有4 只动物进入试验，并且其LD50估算值的范围超出临界值（2.5 倍）。（首次转换的第4 只动物之后，对每次给药进行计算）。

对于LD50和斜率的各种组合，在动物发生死亡/存活转换之后，用4~6只动物即可满足停止试验标准（C）。但在一些情况下，化合物的剂量-反应曲线的斜率较小，可能另外还需要增加动物（总共可达15 只）。

5. 累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding dosage design）

在非啮齿类动物的急性毒性试验中可采用该方法。经典的试验设计通常需要8只动物，设置对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。

剂量的设计可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000mg/kg，也可以采用10、20、40、80、160、320、640、1280mg/kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。

当没有动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或受限制剂量。当在某一剂量所有动物均出现死亡时，MLD和LD50应在最后两个剂量之间。当在某一剂量部分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD50则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间。

若整个试验过程中未出现动物死亡，常常以最高剂量给予动物5-7 天，以为后续重复给药毒性试验中高剂量的选择提供依据。

6. 半数致死量法

半数致死量法是一种经典的急性毒性试验方法，通过对试验结果进行统计学分析，可获得受试物的半数致死量（LD₅₀）