蛋白质免疫印迹实验

上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。

在细胞生物学研究中，有时要对细胞膜分子、胞内分子或表达产物进行定性或／和定量。但由于靶蛋白表达水乎不太高，用细胞裂解液或表达上清进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹（Western blot）检测很难达到实验目的。为此可用特异性识别靶蛋白的抗体进行免疫沉淀，纯化和富集靶抗原。免疫沉淀所获得的蛋白可进行SDS－PAGE电泳，经考马氏亮蓝染色或银染后观察目的蛋白条带。如果免疫沉淀得到的目的蛋白量低于考马氏亮蓝染色或银染的检测下限，可采用 Western blot检测方法，提高检测的灵敏度，达到实验目的。

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(westernblot)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。western blot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

免疫印迹法分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
 

一、蛋白免疫实验原理 

印迹法：将生物大分子物质通过不同的途径转移到固相载体上，转移后的固相载体经淬灭试剂处理后，用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，可与对于的探针反应，显出特异条带。
常见的印记法有Southern、Northern、Western印迹法，分别用于检测DNA、RNA和蛋白质。其中Western印记又称为免疫印迹。
其中，免疫印迹的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫相结合，其主要的操作分为三个过程：
1)电泳：SDS-PAGE分离各蛋白组分；
2)印记：将蛋白质从凝胶转移到固相载体；
3)免疫检测：依次与一级抗体和标记的二抗体反应，通过底物或激发光激发显色，观察目的条带的有无。

Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离，然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应，只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物上是通过电转移仪器完成的。它是将固体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二者结合在一起，然后将外面二侧用Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治”结构，放入电转移仪器上，加入电泳缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝胶上转移到固体支持物上。

二、蛋白免疫操作步骤

1、蛋白质电转移
戴上手套，取下SDS-PAGE凝胶，小心剥离凝胶。裁剪与凝胶同样大的硝酸纤维素薄膜和六层Whatman 3MM滤纸，在硝酸纤维素薄膜左下角剪去一角作为标记。将硝酸纤维素薄膜漂浮于去离子水的表面，使水从膜的下部浸透以去除其间气泡，将Whatman 3MM滤纸在电转移缓冲液中浸湿，用蒸馏水淋洗石墨电极，先将三层浸湿的滤纸放在阳极上，在滤纸表面滚动玻璃棒以除去其间的气泡，再将浸湿的硝酸纤维素薄膜小心平铺在滤纸上，用玻璃棒小心去除气泡。随后将12%SDS-PAGE凝胶舒展平铺在硝酸纤维素薄膜上，用玻璃棒小心去除气泡，再将三层浸湿的滤纸平铺在凝胶上，沁心去除气泡，最后加上石墨电极板，接通电源进行电转移，电流的大小由凝胶的大小决定，为0.65mA/平方厘米。电转移2小时后，停止通电，卸掉电转移装置，取下凝胶进行考马斯亮兰染色，以检测电转移是否完全。小心取下硝酸纤维素薄膜，放在一张干滤纸上，吸干30-60分钟后，开始进显色反应。
2、显色反应
首先进行分子量标记的氨基黑染色。切下转有分子量标记的硝酸纤维素薄膜，用含有0.3%吐温20的PBS缓冲液漂洗三次后（每次15分钟），再将其浸入氨基黑染液中，室温染色5分钟，然后置于氨基黑脱色液中脱去背景，水中漂洗后景干备用。
转有样品的硝酸纤维素薄膜用含有5%脱脂牛奶的PBS缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST第一抗体，平缓摇动，室温保温1小时。然后用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次  30分钟。将辣根过氧分物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白第二抗 体用封闭液稀释50倍后，加入吐温20至终浓度为0.05%，然后与上述漂洗的硝酸纤维素薄膜进行反应，将膜浸于其中，平放在平缓摇动的摇床平台上，室温温育  1小时后，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次5分钟，再加入4-氯萘酚显色液，加入 5μ1 的30%H2O2，将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。

三、免疫印迹技术的注意事项

1、免疫印迹技术所测定的只是目的蛋白的相对含量。因此不能确定一种细胞含有多少目的蛋白，只能确定该蛋白存在与否及其它条件下与其他细胞相比蛋白的含量是高还是低。
2、比较一种目的蛋白在不同细胞或者同一细胞不同条件下的相对含量时，各样平的总蛋白量必须相等。
3、选用合适的 SDS-PAGE 胶浓度，使目的蛋白可以得到较好的分辨。
4、开始电泳和转移欠，一定要确认电极的正负极接头是否正确。
5、在免疫检测中，要注意封闭非特异性结合位点。
6、抗体反应在封口塑料袋内进行，一定要取出袋内的所有旗袍，否则会导致抗体结合不均匀。
7、操作要轻柔，带手套，不要再转移抹上造成任何刮痕。在整个操作中，转移膜要始终在液体中，不能干燥。 

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