近几年，全球多肽药物市场整体处于发展上升期，市场规模复合增速达12%以上，市场规模达到280多亿美元。因为多肽在机体内扮演的角色多种多样，参与众多生理功能，所以多肽药物的发展前景不可限量。而在多肽药物的研发中，由于多肽的诸多特点，造成了其在分析过程中的难点和挑战。美迪西生物药物分析部主任章登吉博士在第一期美迪西云讲堂上，针对多肽类药物生物分析的挑战与对策展开了讨论和分享。
01 多肽药物的特点与研发的现状
小分子肽是介于氨基酸和蛋白质之间的一种生化物质，是多个氨基酸聚合而成的短链，与蛋白质之间一直未有明确界限。多肽的制备方法主要有天然提取，化学合成，基因工程，和生物重组法等，结构相对简单的多肽最常用化学合成的方法制备获得，是多肽药物的主要制备方式。
与传统的化学药物和蛋白质类似药物相比，多肽药物具有以下优势：
多肽作为药物的优势
| 药物 | 分子量 | 活性 | 特异性 | 免疫原性 | 纯度 | 成本 |
| 化学药 | ≤ 500 | 较低 | 弱 | 无 | 不绝对 | 低 |
| 多肽药 | 500-10000 | 高 | 强 | 低或无 | 不绝对 | 高 |
| 蛋白药 | ≤10000 | 高 | 强 | 有 | 不绝对 | 更高 |
多肽药物的活性显著，特异性较强，与受体的亲和性好，毒性较弱且不易在体内蓄积；与蛋白类大分子药物相比，除了多肽疫苗外，多肽类药物免疫原性相对较小，用药剂量少，单位活性更高，易于合成、改造和优化，产品纯度高，质量可控，能够迅速确定药用价值。
据不完全统计，有约500多个多肽产品在全球进入开发阶段，约73种多肽产品，在美国和其它国家获批，150多种多肽在临床阶段，近一半在临床二期，每年陆陆续续都有新的多肽药物获批，近三年获美国FDA获批的多肽药物参见下表：
在80年代早期所研发的多肽长度大多不超过10个氨基酸，现在近几十年内有所增加，趋向于40个氨基酸甚至更长。2019年口服索马鲁肽在美国FDA获批轰动业内，因为长度较大的多肽类药物，想要实现口服、肠道吸收就必须面临肠道中多种肽酶降解的挑战，口服索玛鲁肽的获批无疑为业界在新剂型的多肽药物的开发方面起到了里程碑意义的示范作用。未来多肽药物的研发除了基于剂型的改变和优化，新的多肽药物递送方式、半衰期被延长的修饰化或融合多肽药物将推动此类药物分子的发展。此外，肿瘤抗原肽的开发也成为当前肿瘤研究领域的一大热点。
多肽类分子作为药物亦有其弊端：多肽类药物半衰期短，会被机体快速消除，为了达到有效浓度可能需要频繁给药，成本较高且给患者造成较大的生活负担；稳定性差，容易被酶解，甚至对酸、碱、高温或有机溶剂等敏感而容易失活等。
02 多肽类药物生物分析的挑战
多肽的生物分析主要包括PK药代动力学试验，TK毒代动力学试验以及抗药抗体ADA试验。分析所用到的方法主要包括LC-MS/MS和LBA配体受体结合试验。在多肽药物的分析方法建立中，正是由于多肽的种种特征，造成了其生物分析的挑战和难点，主要表现在以下几方面：
（1）分子量小、半衰期短
检测多肽的关键试剂是抗体。而多肽的分子量小，结构不是很复杂，使得多肽表位数目有限，往往具有类半抗原的性质，抗体难以产生或效价极低，这都为生物分析关键性试剂抗体的制备带来很大的挑战。由于多肽的半衰期短，在机体中往往表现为快速消除，因此生物分析方法的灵敏度和检测下限有了更高的要求。
（2）给药方式与给药剂量
在众多的给药方式中，静脉给药是生物利用度最高的，而许多较长的多肽类药物在血液中的半衰期一般很短，静脉注射后很快就被清除或降解。非静脉给药的方式生物利用度低给生物分析提出了挑战。如许多激素类药物多为皮下给药，且药剂量偏低，因此需要检测方法更加灵敏，更低的检测下限。
（3）内源性对应物的干扰
在对有内源性对应物的多肽分子建立分析方法时，我们需要特异性非常高的抗体试剂才能够区分出内源性和外源性的分子，这就给抗体的制备带来了很大的挑战。同时，由于多肽的内源性对应物在体内是动态变化的，因此能够区分并排除内源性分子干扰分析方法是很必要的。
（4）稳定性的影响
多肽类产品的稳定性问题是在生物分析方法开发中常见的问题，尤其是一些缺乏修饰基团或多肽两端缺乏保护性基团的肽类分子。许多分子在高温、冻存、震荡或酸碱条件下，脆弱敏感，甚至降解或构象变化为生物分析方法各种细节性的质量控制等都带来挑战。
03 多肽药物生物分析的应对策略
针对分子量小，难以制备特异性的高效价抗体的挑战，我们可以采取利用大分子抗原作为载体与多肽进行偶联的免疫策略，并尝试不同的免疫佐剂来激发机体的免疫反应，产生抗体。必要时也可考虑多肽抗原的同源串联重组表达；免疫时尽可能选择与多肽分子同源性相距远的动物种属免疫。
对于多肽分子的内源性对应物的干扰，早做准备，为具有优质选择性的抗体制备提供充足时间，从而构建一个非常特异的针对外源性药物分子的方法，必要时尽可能采用对内、外源性分子分别开发方法以计算扣除内源性分子；也可以结合对所分析的药物和内源性对应物结构和性质上差异点的认识，针对性采取策略消除内源性分子。
针对多肽分子稳定性差、易降解的挑战，有以下方法进行应对，如采样时，选择好抗凝剂或酶抑制剂防范药物降解，利用玻璃管或添加不同的表面活性剂防止多肽的吸附或聚集等。在分析实践中用于配制工作液或储备液的各缓冲液配方很重要，美迪西生物技术药物分析部门有好多基于经验的试剂配方，可以在实践中供大家合作试用。
提高方法的灵敏度可以基于不同的技术平台来开发方法，一般来说，电化学发光法比化学发光，化学发光比荧光，荧光比普通可见光吸收法更容易实现较高的灵敏度。基于不同的信号模式，选用不同的分子标记方式。同样的试剂材料，基于不同的Assay Format改变也可以改善灵敏度。另外基于底物的变化和信号放大系统的应用或组合应用也可以实现灵敏度的提高。
检测平台的优势并非绝对，基于经验和原理将不同策略组合运用尤为重要。
04 美迪西生物技术药物分析部
美迪西生物技术药物分析部灵活运用ELISA, ECL, TRFIA, CLIA, IF, IP, CoIP, qPCR, FACS, ELISpot, 酶学等多种方法，支持前沿生物药如蛋白、抗体（单抗、双或多特异性抗体、抗体片段）、ADC、多肽、核酸、疫苗及细胞基因治疗等药物在早期开发、临床前和临床阶段的PK/TK/Immunogenicity(Total ADA& Nab)/Biomarker&Cytokine等研究评价。目前已经支持了多个涉及Her2, Trop2, Muc1等靶点的ADC药物，和EGFR,PCSK9, IL-17A, IL-6, IL-23, VEGF, CD47, TNF-α, CD20，TIGIT等热门靶点及4-1BB, PD1, PDL-1, CTLA4等免疫检查点的单抗或多抗药物，针对CD19类的CAR-T，还有各类融合蛋白、核酸以及众多涉及糖尿病、心血管、骨、肿瘤等相关疾病的多肽类药物不同阶段的研究工作。
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