一文读懂：蛋白降解靶向嵌合体 (PROTAC）

前 言

传统小分子药物的发现主要集中在直接影响蛋白功能的结合位点或者变构位点上，然而，这种方法通常无法靶向那些缺乏活性位点的蛋白，或活性位点是宽而浅的结合口袋而难以被小分子结合。因此，这类难以被传统小分子靶向的蛋白通常被称为“不可成药”靶点。人类蛋白质组包含大约20000种蛋白，但只有不到 1000种蛋白被验证为药物靶点，据估计，由于缺乏明确的配体结合口袋，约80%的疾病相关蛋白无法通过传统药物进行有效干预。

蛋白降解靶向嵌合体 (Proteolysis Targeting Chimera, PROTAC)，是一种新兴的治疗方式，它利用细胞的天然蛋白质降解机制，即泛素-蛋白酶体系统 (UPS) ，选择性地靶向降解疾病发病机制中的相关蛋白，从而可能调节传统小分子难以靶向的“不可成药”靶点。因此，PROTAC分子的概念自2001年首次报道以来，受到了学术界和工业界的广泛关注，经过PROTAC设计的多次创新和临床前模型的严格评估，首批PROTAC分子ARV-110、ARV-471于2019年进入临床研究。目前，全球共有近40个PROTAC分子已批准临床试验，涉及肿瘤和自身免疫疾病等适应症。其中，最前沿的PROTAC分子ARV-471于2022年底启动了临床III期试验。

PROTAC的作用机制与优势

PROTAC是由两个通过连接子 (Linker) 连接的配体组成的异双功能小分子降解剂：一个配体招募并结合目标蛋白 (POI) ，而另一个配体招募并结合E3泛素连接酶。PROTAC同时结合POI和连接酶，通过形成E3-降解剂-POI三元复合物诱导POI的多泛素化，并随后被26S蛋白酶体降解，之后PROTAC分子将被回收利用，以靶向POI的另一个副本。

泛素-蛋白酶体系统^[1]

PROTAC介导的目标蛋白降解机制^[1]

与传统的小分子药物相比，PROTAC有几个潜在的优势，包括：

1) 传统小分子药物的研究通常集中在开发高亲和力抑制剂上，这些抑制剂通常靶向蛋白的活性位点，或者靶向蛋白的变构位点，以关闭POI的功能（“占位驱动”药理学）。然而，在许多情况下，小分子抑制剂需要和POI的天然底物竞争性结合，难以达到和维持有效抑制POI所必需的高局部药物浓度。PROTAC的作用机制不是影响蛋白的功能，而是介导靶蛋白的降解（“事件驱动”药理学），不需要强作用于活性位点，只需要介导POI与E3泛素连接酶的短暂相互作用，诱导E3-降解剂-POI三元复合物的形成，从而靶向一些传统上认为的“不可成药”靶点。

2) 传统小分子抑制剂必须保持其局部的高浓度才能发挥治疗作用，而长期、高剂量的药物暴露可能增加某些不良反应的风险，并引起累积毒性。而PROTAC“事件驱动”的作用模式，其循环催化能力使其能够催化多个POI的降解，因此能够在亚化学计量浓度下达到POI降解的目的，只需要比较低的剂量就能达到和保持其药效。此外，因为PROTAC催化并且不可逆地降解致癌蛋白，PROTAC具有更持久的治疗效果。

3) 持续使用小分子抑制剂治疗也可能诱导靶蛋白的突变及耐药性。由于短暂的靶蛋白接触足以使POI降解，PROTAC很可能不太容易受到warhead结合亲和力降低的突变的影响，因此，PROTAC有可能克服此类小分子药物耐药性的问题。

2 PROTAC的发展历程

自PROTAC概念于2001年由Sakamoto等人首次发表以来，已经取得了许多重要发展。对肽衍生的PROTAC降解剂、以及免疫调节亚胺药物（IMiD）作为分子胶将底物连接到E3连接酶的发现，为高效的小分子PROTAC的发现和开发奠定了基础。

在过去的几年里，蛋白降解领域经历了爆炸式的增长，合理设计的靶向蛋白降解剂作为潜在治疗药物的时代始于2019年，两种PROTACs进入首次人体试验：ARV-110 （NCT03888612）和ARV-471（NCT04072952），分别靶向雄激素受体（AR）和雌激素受体（ER）。目前，是靶向蛋白降解的初始转化阶段，在这个阶段，设计用于降解致病蛋白的多种分子正在进入临床，有望能够为患者提供临床益处。

PROTAC发展的关键进展时间表^[2]

3 PROTAC的临床研究进展

自2019年两种小分子PROTAC降解剂进入临床试验后，许多其他小分子PROTAC也陆续进入临床研究，主要用于肿瘤的治疗研究，此外还涉及免疫炎症性疾病、神经退行性疾病等适应症。截至目前，国内外共有近40个PROTACs已进入了临床研究阶段，研究较多的靶点包括AR、ER、BTK、EGFR、IRAK4等。然而，尽管有很好的临床前研究成果，很大一部分PROTAC在推进人体临床试验过程中也遇到了挑战，目前还没有PROTAC获批上市。

全球PROTAC管线临床研发进展

4 PROTAC的设计

PROTAC的基本化学组成包括：结合并招募E3连接酶的E3配体、结合POI的配体和连接E3和POI配体的Linker。

PROTAC的设计，主要从如下几个方面考虑：

(1) 靶点选择 

根据PROTAC独特的、“事件驱动”的作用机制，靶点的选择通常可以参考如下6项原则：

1) 经典的“不可成药”靶点。传统上“不可成药”靶点，如KRAS、信号传导及转录激活蛋白3 (STAT3) 等，已有报道成功地使用蛋白降解剂进行了降解。

2) 耐药突变靶点。肿瘤靶向治疗的耐药性通常是由于突变导致的，这些突变或者损害了传统小分子抑制剂与靶蛋白的结合和/或导致靶蛋白的过度表达（原则3），以至于药物不能再获得足够的疗效。PROTAC可以成功地靶向这类靶蛋白，如BTK的C481S突变，BTK中的C481S突变阻止了临床上BTK抑制剂的共价结合活性，但这些抑制剂的弱非共价结合亲和力足以衍生为活性PROTAC。

3) 基因扩增和/或蛋白过表达。如转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC) 对雄激素受体 (AR) 的持续依赖，由抗雄激素治疗的突变和过表达驱动，再加上该靶点已知的临床有效性，因此，临床研究中的PROTAC很多选择AR作为靶点。

4) 具有不同异构体表达或定位的靶点。由于蛋白家族中异构体结合位点的高度同源性，用小分子抑制剂实现异构体选择性具有一定的挑战性，而研究发现即使选择非选择性靶蛋白结合配体设计的PROTAC，也可能表现出异构体的特异性降解，例如从双重CDK4/6抑制剂中开发出选择性CDK4或CDK6降解剂。

5) 脚手架蛋白。脚手架蛋白通过招募其他蛋白形成复合物而转导信号，而不是通过自身的催化活性来发挥其功能，因此很难用传统的小分子直接靶向。然而，这类蛋白可以用蛋白降解剂靶向。

6) 蛋白聚集。蛋白质聚集与神经退行性疾病有关，包括阿尔茨海默病和帕金森病，蛋白降解方法也正在这一领域进行探索。

(2) E3连接酶的选择

为了设计有效的PROTAC，关键是要选择对E3连接酶具有足够结合亲和力的E3配体，并且在不影响其泛素化活性的情况下招募功能活跃的E3连接酶，然而这种E3配体的可用性是有限的。在人类基因组中编码了600多种E3连接酶，迄今为止只有大约10种E3连接酶被成功用于靶向蛋白降解。

目前，靶向蛋白降解剂广泛使用的两种E3连接酶是 von Hippel-Lindau (VHL) 和cereblon (CRBN) ，主要原因包括：首先，VHL和CRBN可以使用现有的、容易获得的小分子结合配体，且具有适合Linker连接的结构位点；其次，VHL和CRBN可以灵活稳定地降解各种靶蛋白；第三，VHL和CRBN的表达相对普遍，能够实现高水平的系统性蛋白降解。

常用的基于沙利度胺的CRBN配体和可能的Linker连接方式^[3]

常用的VHL配体和可能的Linker连接方式 ^[3]

除了CRBN和VHL之外，其他常见的E3配体还包括IAP及MDM2，E3连接酶的新配体的发现和开发也正在进行中，如RNF4、RNF114、DCAF16、KEAP1、DCAF11和FEM1B等。由于不加区分的系统性靶蛋白降解可能导致不可接受的毒性和相对狭窄的治疗指数，组织特异性或肿瘤特异性E3连接酶的配体开发受到越来越多的关注。通过靶向肿瘤特异性E3连接酶，特异性地降解肿瘤组织中相关蛋白，原则上可以提高PROTAC的耐受性。

(3) POI配体设计

POI配体的选择对于PROTAC的成功设计也是至关重要的。通常，选择POI配体的溶剂暴露区域作为Linker连接位点，以尽量减少Linker和E3配体对PROTAC-POI结合的干扰。

PROTAC的设计可利用已报道的靶蛋白结合配体，这些配体最初被设计为靶蛋白抑制剂。随着对新的靶蛋白降解的探索，特别是传统的“不可成药”靶点，识别新的靶点-蛋白结合配体的需求增加。DNA编码库 (DEL) 技术是一种可用的蛋白降解剂的配体鉴定和开发的方法，DEL技术筛选的原理中，配体结合位点和蛋白功能活性无关，且在没有更多的结构支持的情况下，能够提供一种潜在的Linker连接位点（即DNA条码标记位点）。DEL技术在发现新的分子胶降解剂、E3连接酶配体等方面也有潜在的用途。

(4) Linker设计

靶蛋白与E3连接酶配体之间使用的Linker类型和长度是至关重要的，通常使用不同长度的烷基或聚乙二醇 (PEG) Linker，以确定靶蛋白和E3连接酶之间的最佳距离。由于蛋白之间的空间位阻，Linker太短会阻止高效三元复合物的形成；太长的Linker可能会使三元复合物失去蛋白降解活性。在某些情况下，Linker在三元复合物中不只起到连接作用，还可以与蛋白表面形成接触。

一些研究已经证明，Linker的构象约束可以通过降低自由度或锁定生物活性构象来进一步提高活性。构象限制性Linker已被开发用于系列SMARCA2/4降解剂、AR降解剂、及ER降解剂ARV-471等。此外，还可通过Linker的结构设计，来调节PROTAC的药代动力学性质。

5 PROTAC药物开发的难点与挑战

虽然PROTAC具有变革药物发现领域的潜力，然而，由于其结构特性的固有缺陷，对PROTAC的临床转化构成了重大挑战，限制了其临床应用：

1) 由于E3泛素连接酶在正常组织和疾病部位的非选择性表达，导致PROTAC的脱靶活性，从而可能引起副作用的发生。

2) PROTAC分子量（>800 Da）相比于传统小分子药物要更大，通常水溶性较差，往往导致较低的生物利用度。

3) PROTAC的高极性表面限制了分子的渗透性，极大地阻碍了PROTAC分子透过细胞膜和生理屏障。

4) 细胞内较高浓度的PROTAC倾向于形成POI-降解剂的二元复合物，而不是形成三元复合物，产生Hook效应，从而降低靶蛋白的降解活性，并阻碍了其体内剂量的合理设计。

PROTAC的主要局限性 ^[4]

6 新一代PROTAC

虽然通过结构修饰有望克服PROTAC的某些限制，但同时优化其理化性质以能够有效地在体内应用，这是一个巨大的挑战。新一代PROTAC的设计可能解决这些难题，而不是仅仅依赖于过度的化学优化。这类新一代PROTAC在特定组织受到外源性或内源性刺激后，恢复POI降解的功能，而在其他组织保持无活性状态，从而有望实现高度靶向治疗，减少副作用。

例如：
(1) 点击释放性PROTAC (Click-release PROTAC)
(2) 酶响应性PROTAC (Enzyme-responsive PROTAC)
(3) 谷胱甘肽响应性PROTAC (GSH-responsive PROTAC)
(4) 低氧响应性PROTAC (Hypoxia-responsive PROTAC)
(5) 光激活性PROTAC (Photo-activatable PROTAC)
(6) 辐射响应性PROTAC (Radiation-responsive PROTAC)
(7) 活性氧响应性PROTAC (ROS-responsive PROTAC) 等

❖ 点击释放性PROTAC的开发 ，有望克服传统PROTAC分子量较大的限制，然而，因为每个前体分子表现出不同的PK性质，需要考虑这些前体的体外反应活性和合适的分子比例。

❖ 光激活性PROTAC的一个主要限制因素是紫外光缺乏足够的组织穿透能力，这阻碍了这些光激活PROTAC前药的开发和应用。为了解决这个问题，科研人员探索开发了一种在实体肿瘤中激活PROTAC前药的替代策略，利用内源性特征，如缺氧、GSH和ROS等水平升高来激活PROTAC，以实现精准的蛋白降解。

虽然这些方法具有较大开发潜力，但在PROTAC前药设计中需要设计额外的响应部分，不可避免地导致PROTAC分子量的增加，这可能会给它们的成药性带来新的挑战。

新一代PROTAC设计中使用的策略^[4]

配体修饰 

新一代PROTAC还可通过配体修饰，从而选择性靶向特定细胞，如叶酸 (Folate-targeting PROTAC) 、抗体 (Antibody-PROTAC conjugate) 和适配体 (Aptamer-PROTAC conjugate) 等。

由于这类配体修饰的PROTAC，能够选择性地结合癌细胞表面表达的特定受体或生物分子，有效地将降解剂特异性地输送到肿瘤组织，最大限度地减少对健康组织的暴露，因此已成为肿瘤细胞靶向蛋白降解的潜在治疗药物。

然而，设计有效的配体修饰PROTAC前药需要仔细考虑几个因素：
❖ 选择合适的配体，对其靶受体表现出高亲和力和选择性，是实现最佳治疗效果的关键；
❖ 确保循环稳定性，防止在到达病变组织之前过早降解或丧失活性；
❖ 合理的配体设计，促进有效释放活性PROTAC内化到癌细胞。
总之，需要仔细控制释放的时间和程度，以最大限度地提高治疗效果，同时尽量减少潜在的不良反应。

纳米颗粒递送系统

此外，纳米颗粒递送系统也可能成为一种有效的替代策略，如调节PROTAC的水溶性、细胞渗透性和改善体内药代动力学性质，以及增强PROTAC在病变组织中的积累，减轻蛋白质降解剂的组织外靶向副作用，以达到更好的治疗效果。用于药物递送的纳米颗粒大致可分为有机纳米颗粒和无机纳米颗粒，有机纳米颗粒进一步分为聚合物纳米颗粒和脂质纳米颗粒。

尽管具有很大的潜力，PROTAC纳米颗粒递送系统仍然面临着一些限制其广泛应用的挑战：

❖ 确保药物递送系统中使用的载体材料的生物相容性，应仔细评估和选择在体内使用安全且不会引起不良反应或毒性的材料, 在优化效果的同时确保其副作用在可接受的范围内；

❖ 另一个重要的考虑因素是质量控制的可靠性，由于这些递送系统涉及复杂的配方和工艺，因此在整个生产过程中建立健全的质量控制措施至关重要；

❖ 额外的载体材料和药用辅料可能会增加PROTAC的生产成本，应评估生产工艺的放大可行性和成本效益，以确保有效的大规模生产而不影响产品质量。

总结与展望

PROTAC降解剂的开发在过去的几年中得到了迅速发展，包括从药物化学设计和结构优化，到临床前实验的活性评估，再到临床研究的验证。临床前数据的报道，有力地证明了PROTAC对其靶点的特异性，以及抑制肿瘤生长的活性。此外，临床前数据表明，蛋白降解剂对小分子抑制剂治疗后产生的耐药性突变具有活性。尽管还缺乏足够临床数据，但PROTAC已显示出对晚期前列腺癌、乳腺癌或慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的疗效，包括分别具有AR、ER和BTK耐药突变的患者。PROTAC分子的疗效和安全性，在更大的患者群体中进行探索是非常有必要且有益的。

由于PROTAC研究较多及前沿的靶点，包括靶向AR、ER或BTK的ARV-110、ARV-471和NX-2127等，这些靶点此前已在疾病的发病机制中验证了其作用，下一步的关键是要确定PROTAC技术是否能够真正实现经典的“不可成药”靶点的降解。比如，目前在临床I期研究中的STAT3降解剂KT-333、KRAS G12D 降解剂ASP-3082，分别用于复发和/或难治性淋巴瘤和晚期实体瘤、晚期KRAS G12D 突变实体瘤患者的治疗。除了在癌症的治疗应用，PROTAC技术也可用于靶向参与其他疾病发展的蛋白，例如靶向IRAK4降解用于自身免疫性疾病的治疗，从而提供更广的治疗潜力。

此外，蛋白降解剂的靶向递送，可能实现最大限度地减少全身递送的潜在毒性。目前，已经报道的各种递送系统，包括抗体-PROTAC偶联物等，可以在肿瘤中被光、叶酸或活性氧等选择性激活，以实现PROTAC的靶向递送。

尽管PROTAC在临床前和临床中都显示出治疗潜力，但PROTAC的开发也面临着挑战，如患者是否会对蛋白降解剂产生耐药性。目前，临床前的研究报道有限，迄今为止的大多数蛋白降解剂耐药性的产生是通过影响泛素-蛋白酶体系统的改变，例如E2泛素结合酶的功能丧失、E3泛素连接酶的组分或E3连接酶活性的调节因子，而不是靶蛋白的改变。一项临床前研究显示，药物外排泵MDR1的上调是对蛋白降解剂产生耐药性的机制之一。需要对长期使用蛋白降解剂治疗的患者进行评估，以确认临床前观察到的耐药机制是否也会发生在临床中。

总而言之，在过去的二十年里，PROTAC经历了从实验室到临床研究的漫长旅程，在2019年首次进入临床开发，初步临床数据的结果表明PROTAC具有用于癌症治疗的潜力，更多关于PROTAC的临床研究正在进行中。除了PROTAC之外，其他靶向蛋白降解技术也正在开发，包括同样基于泛素-蛋白酶体系统的分子胶、及基于溶酶体系统的溶酶体靶向嵌合体 (LYTAC) 和自噬靶向嵌合体 (AUTAC) 等，这些技术扩展了TPD的范围，为疾病的治疗提供了广阔的前景。

参考文献：

[1] Brandon Dale et al. Advancing targeted protein degradation for cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 2021, 21(10): 638-654.
[2] Miklós Békés et al. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue. Nat. Rev. Drug Discov.2022, 21(3): 181-200.
[3] Aleša Bricelj et al. E3 Ligase Ligands in Successful PROTACs: An Overview of Syntheses and Linker Attachment Points. Front. Chem. 2021, 9: 707317.
[4] Chao Wang et al. New-generation advanced PROTACs as potential therapeutic agents in cancer therapy. Mol. Cancer 2024, 23(1): 110.
[5] Deborah Chirnomas et al. Protein degraders enter the clinic-a new approach to cancer therapy. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2023, 20(4): 265-278.

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