单细胞测序的重要性及应用方向

单细胞测序的重要性

随着第二代测序(next generation sequencing，NGS) 技术和第三代测序( third generation sequencing，TGS)技术的飞速发展，引起生物研究领域的巨大变革。以前，需要从大量细胞中获取足够多的DNA 进行测序，因此测序结果是这些细胞“整体”的表征。然而，由于细胞异质性，相同表型的细胞的遗传信息可能存在显著性差异，很多低丰度的信息会在整体表征中丢失。为了弥补传统高通量测序的局限性，单细胞测序技术应运而生。

单细胞测序技术是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用，正成为生命科学研究的焦点。2013年单细胞测序技术被Nature Methods评为年度技术（图1左）。同年，《科学》杂志（Science）将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，认为该技术将改变生物界和医学界的许多领域。由于单细胞测序技术广阔的应用前景，2015年单细胞测序技术再度登上Science 转化医学封面（图1右）。图1.单细胞测序技术荣登顶尖杂志年度封面 (图片来源http://t.cn/R840r7W；http://t.cn/RQHjnW3)

2017年10月16日，与“人类基因组计划”相媲美的“人类细胞图谱计划”（图3） 首批拟资助的38个项目正式公布。人类细胞图谱计划是一项大型国际合作项目：根据独特的分子信息（如基因表达）对所有人类细胞种类进行定义，并将这些信息与传统的细胞学表述（如位置和形态）相关联。其中一项关键的技术就是单细胞测序。

相信未来单细胞技术，将会大大改变人类的科学研究以及临床应用，尤其是在肿瘤、微生物、神经科学、免疫学等领域。下面我们将重点介绍近年来单细胞技术在以上领域的重要发现。

单细胞测序的应用

1、 在肿瘤研究中的应用

    2012年3月2日，深圳华大基因研究院在肿瘤研究上获得突破性进展，于国际著名学术期刊《细胞》（Cell）上同时发表两篇研究论文。该工作研发了一种解析单细胞基因组的新方法，并将该方法应用于原发性血小板增多症（一种血癌）和肾透明细胞癌（一种肾癌）（图4）的肿瘤内部遗传特征研究。此新方法解决了之前无法解决的肿瘤高异质性难题，为深入研究癌症发生、发展机制及其诊断、治疗提供了新的研究思路并开辟了新的研究方向。

图3.华大单细胞测序技术分别应用于血癌和肾癌研究

    2016年，麻省总医院MGH、Broad研究所的研究人员在单细胞水平上对脑瘤进行基因组分析，首次在人类脑瘤样本中鉴定到了癌症干细胞及其分化后代 。研究人员分析了六个早期少突胶质细胞瘤样本的四千多个肿瘤细胞，发现肿瘤细胞在发育上可以分为三类。其中一类比较像神经干细胞，另外两类具有一定的分化特征。研究结果证实了癌症干细胞是少突胶质细胞瘤的主要生长源，这些细胞将成为很有前景的治疗靶标。

    图4:在单细胞水平上对脑瘤进行基因组分析

2、在微生物研究中的应用

    单细胞测序在微生物领域也取得了重要突破。2017年，来自美国UCSF的研究组首次实现原核生物的微生物单细胞测序技术。图5展示了该研究的详细流程。

    图5：基于微流控技术实现微生物单细胞测序

3、在神经科学中的应用

单细胞测序技术帮助科学家更深入的了解大脑神经细胞。2017年，Salk生物研究所领导的团队根据甲基化和调控特征，区分小鼠和人类大脑样本中的神经元亚型，并鉴定出人类额叶皮质中一组新的神经元。研究人员利用单细胞甲基化测序分析小鼠和人类额叶皮质样本中近6200个神经元，并根据甲基化和调控元件特征对已知的神经元亚型进行聚类。此外，他们还指出人类大脑中存在一种新的神经元亚型，称为“第6层兴奋性神经元”，它们有着独特的甲基化标记。

    这篇论文的通讯作者之一、Salk研究所的计算神经生物学研究人员Margarita Behrens表示：“我们的研究表明，我们能够根据神经元的甲基化组来清晰定义神经元类型。这有助于我们了解同一区域、外表相似的两种神经元为何表现不同。”

    图6: 通过高通量单细胞甲基化测序得到小鼠和人额叶皮层神经元细胞的亚型

2018年初，张鹍教授团队在Nature Biotechnology上发表了一个基于全新单细胞核测序方法的成年人脑第二代单细胞图谱。该研究通过结合基于微流体的单核测序（snDrop-seq）和单细胞转座体超敏性位点测序（scTHS-seq）的方法，不仅能利用转录组学分析鉴定不同功能的细胞类型，还能通过表观遗传学特征更好描述这些表达图谱是如何调节或者维持的。该研究检测了超过60，000个来自成人大脑皮层和小脑的单细胞，发现了35种不同的神经元和神经胶质细胞亚型。并且发现了这些细胞中哪些亚型更易受到不同脑部疾病常见危险因素的影响。

4、在免疫学领域的应用

由于传统的免疫细胞分析方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性，所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，从而理解机体复杂的免疫机制。

2017年，Ido Amit团队在大脑中发现一种新型免疫细胞——disease-associated microglia（DAM），证实DAM细胞负责降解死亡的细胞以及与阿尔兹海默症相关联的蛋白病斑。研究人员强调，只有对单个细胞进行RNA测序才能发现罕见的小胶质细胞，从而为治疗包括阿尔兹海默症等在内的神经类疾病提供新方法。

    2017年，来自Broad研究所等机构的科学家们借助单细胞基因组学技术在人类免疫系统中鉴定出了新型细胞。他们通过对健康献血者分离获得的约2400个单细胞RNA进行了测序，并富集HLA-DR+细胞系，尝试 对DC细胞和单核细胞的分类进行重新鉴定和修订。这一成果是人类细胞图谱（Human Cell Atlas）计划的首批重要发现之一。该计划旨在描述人体内的每一个细胞，以期加速生物医学的发展，将彻底改变医生和研究人员如何理解、诊断和治疗疾病。

    图9.人类血液中树突细胞和单核细胞图谱

结语

单细胞测序技术从诞生至今，仅仅短短数年的时间，便取得了飞速的发展以及瞩目的成果。2009年、2010年，在顶级期刊发表的单细胞测序技术类文章数均仅有3篇。而到2013年、2014年该数目分别为23及27篇。现在单细胞测序技术越来越受到科研工作者及临床工作者的青睐，每年有越来越多的重要成果发表在顶级期刊上。

而华大基因，在单细胞测序领域也取得了重大突破。2012-2017年，在单细胞测序领域华大基因一共发表了15篇文章，影响因子最高44，累计影响因子高达189。下面图表是华大基因在单细胞测序领域的代表性文章：

    表1.华大单细胞测序高分文章列表