PCR技术服务及其运用

PCR产物的检测

• 凝胶电泳分析：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 酶切分析
• 分子杂交：Southern印迹杂交、斑点杂交
• 核酸序列分析

PCR的反应条件

• 反应温度（变性、退火、延伸）
• 反应时间（变性、退火、延伸）
• 循环次数（PCR效率及产物量）

PCR反应的特点

• 特异性强：引物与模板结合的特异性及聚合酶的忠实性  
• 灵敏度高：指数增长，从pg (10-12)可扩增至 mg (10-6)水平 
• 简便、快速：2～4 小时完成扩增
• 对标本的纯度要求低：DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板 

1.1 PCR技术概述及原理

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是在DNA聚合酶的催化下，以特定的DNA为模板，以特定的核酸片段即PCR引物为扩增起点和终点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外体系中复制出大量与母链模板中所需的DNA片段互补的子链DNA的过程。
PCR的最大特点是其扩增产物的特异性、扩增效率的灵敏性、扩增程序的简便性。引物序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。PCR技术是一种DNA体外合成放大技术，具有扩增效率高，扩增特异性高，扩增体系和技术简便成熟的特点，是当今生物学相关实验室最广泛使用的一项技术。

1.1.1 PCR的循环步骤

PCR反应过程实际上是一个温度循环变化的过程，一般包括变性---退火---延伸三个基本反应步骤，其基本步骤如下：
（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热至92～96℃以上保温1～3分钟，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；虽然变性时间决定于多种因素模板DNA的复杂性、反应管的几何学、PCR仪的种类甚至反应体积，但是实际经验中，94℃保温3分钟即可以满足绝大部分反应的需求。另外，对于GC含量较高的DNA模板，加入甘油、延长时间、应用核酸类似物可以提高PCR产物的产量。
（2）模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，37～65℃保温0.5～1分钟，寡核苷酸引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；这一步的温度取决于引物与靶序列的同源性程度和寡核苷酸引物的碱基组成。引物的摩尔数由于绝对大于靶序列，因此它们与互补序列的配对速度在反应中比模板双链之间的重新配对要快几个数量级。
（3）引物的延伸：DNA模板---引物结合物体系在68～72℃延伸保温相应时间（此步骤具体温度视热稳定DNA聚合酶的种类而定，而保温时间则在考虑DNA聚合酶效率的基础上，依据反应产物的长度决定，如目前最常用的DNA聚合酶Taq酶在72℃下每分钟约可以扩增长度为1Kb左右的DNA片段，因此要扩增两2Kb的DNA片段时本步骤的保温温度应设置为72℃、时间为2分钟），在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性---退火---延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板使得每个循环中新扩增的目的片段数量以指数式增长。经过一定数量的循环之后，待扩目的DNA片段的数量将被扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

1.1.2 PCR一般反应体系

PCR反应的组分一般包括：（1）模板DNA；（2）引物；（3）四种脱氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反应缓冲液、Mg2+等。目前，PCR反应已经全部在PCR仪中进行，且普遍采用商业化的PCR试剂盒进行PCR反应，因此一般研究者只需要准备自己的模板DNA和PCR引物，然后按照产品说明书进行操作即可；对于PCR系统各个组分的了解是进行PCR实验的基础，尤其是在扩增结果不理想的时候，可依此改进实验以获得满足实验需求的扩增结果。

一般普通的PCR反应体系中主要包括下列组分：
（1）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，通常标准分子生物学方法制备的样品都可以直接作为模板使用，无需特别处理，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。需要指出的是，模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。另质粒、预先扩增的到的片段等小片段DNA作模板时，扩增的效率会明显高于基因组DNA为模板的反应，因此在使用小片段DNA作模板时，要尽量降低模板的量，10-9g至10-12g级即可。
（2）引物：引物在PCR反应中的终浓度一般为1μmol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。商业公司合成的干粉状引物一般可用ddH2O或溶解为100μmol/L，－20℃储存，使用时按比例加入体系即可。
（3）底物（dNTPs）：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。需要说明的是，dNTPs的浓度改变会影响有效的Mg2+浓度，因此若dNTPs得浓度增加，Mg2+浓度亦应该增加。
（4）镁离子：Mg2+能影响反应的特异性和PCR的产率。Mg2+的工作浓度为1.5～2.0mM，其对应dNTP为200μmol/L；以Taq酶为例，由于dNTP与Taq酶竞争Mg2+，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。镁离子的使用是严格的，其作用优于锰离子，钙离子则无效。
（5）无Mg2+buffer：主要有H2O、KCl、Tris组成。Tris用于控制反应体系中的pH值，保障DNA聚合酶的反应活性；不超过50mM的KCl可以降低退火温度，但是过高的KCl会抑制DNA聚合酶的活性。
（6）DNA聚合酶：DNA聚合酶是PCR扩增得以进行的保证，目前的PCR技术中使用的都是热稳定性酶，避免了PCR技术应用初期需在每一次变性后重新加酶的繁琐工作。目前最常用的Taq酶能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。Taq酶的缺点是没有3’→5’的外切酶活性，因此没有校正功能，某种dNTP或Mg2浓度过高,会增加其错配率，因此在进行精密PCR实验室，建议使用有3’→5’的外切酶活性的高保真的聚合酶。聚合酶的用量一般按试剂盒说明书的推荐用量添加即可。
除了以上标准成分以外，一些研究者或者试剂盒推荐在体系中添加明胶、TritonX-100或BSA（小牛血清白蛋白）来增加酶的稳定性，可能的原因是它们起着减少PCR管对聚合酶的吸附作用，以使聚合酶尽可能参与到反应中。
另外，甘油、二甲亚砜、甲酰胺可以提高特异性,这些成分可能是通过降低解链和链分离温度使模板变性更容易并提高了引物退火特异性来实现提高PCR反应特异性的目的。

1.2引物设计

1.2.1 PCR引物设计的一般思想

PCR反应扩增成功的一个关键即是引物的正确设计，尤其在目前已有大量PCR试剂盒免去研究人员对实验体系、条件的繁复摸索的条件下，研究者只需自行准备模板和引物即可。
引物设计的核心思想是在扩增的特异性和效率之间取得平衡。特异性指扩增得到非目标片段的频率；扩增效率指在每一个循环中一对引物引起的扩增产物的产量与理论上应获得的产量的接近程度。
目前市面上提供大量的引物设计软件，这些软件基本都基于以下几点考虑引物质量：可能引起非靶序列的假阳性扩增，引物本身的发卡结构，引物二聚体的形成等，假阳性扩增与引物特异性相关，引物发卡结构和二聚体的形成对扩增效率有较大影响。

1.2.2引物的组成

引物的主体通常是一段5’→3’的与靶序列严格互补的寡核苷酸短链，根据实验的不同目的，许多时候会在引物的5’添加限制性酶识别位点等与本次PCR无关序列或其它各种修饰,这些修饰通常不会影响引物的第一次正常退火和扩增，而在后续的循环中，由于已有可互补的模板，体系亦可正常进行扩增。

1.2.3引物设计时应考虑的几个因素

（1）引物长度：PCR扩增的特异性由引物的长度和退火温度控制，当反应的退火温度接近Tm值时，18～24个碱基长度的引物有着卓越的特异性。
理论上认为在引物上每增加一个碱基特异性会增加4倍，因此引物越长碱基数越多特异性越突出，但是引物越长，退火时可以被其引发的模板也会越少，再经过指数扩增期放大后，扩增产物会明显减少。因此若非特殊需要，一般引物的互补序列部分不需要超过25个碱基。
而引物越短，其在退火时结合到靶序列上的几率就越高，因此引物中与靶序列互补部分碱基太少会引起不必要的非目标扩增产物。
（2）GC%和Tm值：Tm值指的是引物与模板结合的双链体的解链温度。较低的Tm值导致引物特异性的丧失，这种情况下将出现大量的非特异性扩增产物。Suggs在1981年提出的Tm＝2（A+T）+4（C+G）公式，由于简便和相对精确一直受到广大研究者的好评。对于一条大约20个碱基的引物，基于上述公式，可以发现当CG%在50%左右时Tm值约在56℃～62℃，较适合进行PCR反应，因此在设计引物时，应选取（A+T）和（C+G）数量大致相当的序列。尤其应注意使上下游两条引物的Tm值尽量接近，比较理想的情况是相差2～3℃以内，这样可以使PCR反应中进行退火时上下游引物结合靶序列的效率相当，以获得稳定且足够数量的扩增产物。
需要特别指出的是，在进行PCR反应设置退火温度时，不管是公式推算还是软件预测或者引物合成公司提供的Tm值，实际上都只能用于参考，每一个PCR反应的实际退火温度理论上都是未知的，通常第一次扩增时退火温度设置为参考Tm值+2或4℃，之后根据扩增结果进行调整。
（3）引物在靶序列内的位置：除了有特定而精确的目的片段以外，大部分的实验中，PCR反应的产物长度是可以在一定范围内进行适度选择的，根据PCR产物的用途、模板的特点和所用聚合酶的特性，可以选择合适的产物长度，一般实验中的PCR反应通常选择在150～1000bp之间，而若只是为了检查某段特异性序列则只需要120～300bp就已足够。
在靶序列上选择引物的时候，注意避开成串单一碱基的区域，避开连续的CG序列，尽量选择四个碱基分布较随机的区域，这样可以减少引物自身同源的机会，避免扩增过程中引物的不必要消耗；同时在上下游两引物之间也不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。另外尤其要注意3’末端的序列，若非有特定作用，这段序列一定要与模板DNA严格配对，末位碱基最好选用A、C、G，因为T错配也能引发链的延伸。

1.3 PCR的特异性、效率和忠实性

PCR的特异性、效率和忠实性是体现一个PCR实验的质量的三个重要指标。特异指一个PCR反应只产生一个扩增产物，即预期的靶序列。效率指每个循环里扩增的实际产物的量与理论上应该达到的量的接近程度。忠实是指在PCR反应过程中，由DNA聚合酶诱导的错配是可以忽略不计的。
这三个参数中的每一个都受到PCR反应中众多成分的影响，包括缓冲体系、酶、模板甚至PCR循环程序，但最遗憾的是，高特异性的反应条件与高产量的反应条件并不一致，同时高保真也往往导致低产率。因此在设计PCR实验时，要根据实验目的，有针对性地对这三个参数有侧重地优化。如在片段长度多态性分析时，PCR产物的产量和特异性就比忠实性重要；而若是研究个别DNA分子或稀有突变，忠实性的重要性不言而喻。
特异性是PCR的基础，它首先取决于引物设计与模板的精确互补。一套理想的引物能有效地与靶序列杂交，而与模板中出现的其它序列的杂交可以忽略不计。一般引物与模板中非靶序列发生4个或更少连续碱基互补都不会在电泳时体现出来。
PCR反应的效率影响特异性产物的积累，根据Chien等人给出的靶序列的累积与循环数的函数关系，扩增效率最高的时期为29个循环之前的指数增长期，之后每次循环的效率就开始大大降低，产物停止指数积累，此时理论上靶序列的拷贝数已达到1012，而1012拷贝的特定序列对于绝大多数分子生物学实验已满足要求，且PCR的许多应用尤其是定量实验都要求扩增在指数生长期完成，因此，一般PCR反应都在29个循环之前取出，没有必要再增加循环数。
PCR反应的忠实性主要与酶有关，虽然可以通过改变反应缓冲液的条件大大提高忠实性，但是也远比不上更换高保真的聚合酶的效果。聚合酶的高保真能力体现在其拥有3’→5’的外切酶校正活性。需要指出的是，不论是否使用高保真的聚合酶，PCR的过程都有可能有错误碱基渗入，因此在对忠实性有要求的实验中，经PCR得到的序列必须测序验证。

1.4 PCR的优化

在PCR实验中，最显而易见的一对矛盾是扩增时产生大量不确定、不需要的产物，或者没有扩增到任何产物，这个矛盾的实质就是PCR的高特异性和高效率所需的条件不一致。
下面给出有利于增加PCR特异性的部分条件，往反方向调整即可增加扩增效率，但是会降低特异性，因此最佳目标是寻得两个方向之间的平衡。

有利于增加PCR特异性的调整条件：
（1）使用热启动技术
（2）使用降落PCR技术
（3）优化引物设计
（4）加入或优化增强剂
（5）优化反应体系，包括pH值，甚至改变反应体积
（6）提高退火温度
（7）提高模板的变性效率
（8）降低Mg2+浓度
（9）降低dNTPs的浓度
（10）降低聚合酶的量
（11）降低引物浓度
（12）降低模板浓度
（13）减少循环数
（14）减少每个循环中各部分的时间
如上所述，通常影响一个PCR反应的条件很多，因此，在实际操作中假如进行全矩阵分析寻找最佳条件将费时费力，因此，研究过程中可以只针对相关的主要变量进行调整。在重点考虑引物与模板的配对及酶的忠实性的情况下，Mg2+浓度和退火温度是对扩增影响最显著的因素，因此可以只针对这两个变量进行简单的小矩阵分析。降落PCR实质上就是一个在系列梯度温度中寻找到有效退火温度，并适度保证特异性的方法。

1.5 PCR常见问题

PCR产物的电泳检测与保存
PCR结束后最好立即检测，一般不要超过48小时；产物保存于－20℃待用，或者纯化后保存。

假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有：（1）模板核酸的制备；（2）引物的质量与特异性；（3）酶的质和量；（4）PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：（1）模板中含有杂蛋白质；（2）模板中含有Taq酶抑制剂；（3）模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；（4）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；（5）模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：（1）选定一个好的引物合成单位；（2）引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；（3）引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；（4）引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μl、30μl、50μl，或100μl，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μl 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性，退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

假阳性，出现扩增条带与目的靶序列条带一致
有时出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：（1）整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。（2）空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：（1）引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。（2）Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。（3）酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：（1）减少酶量，或调换另一来源的酶。（2）减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。

1.5 PCR的应用

PCR技术自1985年建立以来，发展迅速，表现出极其广泛的应用价值.基于PCR的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对PCR技术进行研究和改进，使PCR技术不仅得到了进一步地成熟完善，更在此基础上派生出了许多新的应用领域与方法。

PCR技术首先在基因工程领域有着不可替代的贡献：
对DNA片段在按特殊要求进行修饰上PCR技术提供了一种比原有技术更快更简单的方法。因为与重组DNA技术相比，PCR技术本身就较为简单；而且它还可以通过化学合成寡聚核苷酸引物的方法更为简便地改变DNA的碱基序列，而不需对DNA片段进行限制性内切酶和连接酶操作；再者，PCR技术还可能很方便地进行序列改造，如在引物5'端加上一个“添加”序列。此外PCR技术产生的修饰产物效率几乎可达100%。
此外通过PCR引物引入DNA序列变异的原理是非常有用的。最为简便的是它可以使PCR产物的一条链或另一条链或两条链都特异性地标记上放射同位素、生物素或荧光素。它还可以在DNA序列的任一位置上特异性地进行位点替代、缺失、插入或重组，同时它还可以将本来毫不相关的序列准确地连接起来，并由此获得可遗传的突变。
近年来，基于PCR的各种新技术不断更新、完善、发展，如原位PCR技术、连接酶链反应技术（Ligase chain reaction，LCR）、依赖核酸序列的扩增技术（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、转录依赖的扩增系统（Transcript-based amplification system，TAS）、标记PCR技术（Labelled Primers，LP-PCR）、彩色PCR技术（Color Complementation assay PCR，CCAPCR）、反向PCR技术（reverse PCR）、不对称PCR技术（asymmetric PCR）以及目前热火朝天的实时荧光定量技术（real time PCR）等等，不仅应用在科研领域，也在动、植物检疫、食品安全、司法鉴定等社会生活中的方方面面有着越来越大的应用价值。希望通过自己的努力，使其成为一名玩PCR的高手。

【主要参考书目】
（1）C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒，PCR技术实验指南．科学出版社：北京，2000
（2）萨姆布鲁克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯 T．分子克隆实验指南．第二版．北京：科学出版社，1998