原代细胞培养技术

一、分离阶段注意事项

1、组织块培养法
1）组织块接种后的前3天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）加入的培养液不适合过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3）用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。
4）为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。细胞培养过程中，胶原中的促细胞贴附因子先吸附于培养瓶底壁上，悬浮的圆形细胞再与已吸附有促贴物质的底壁附着。

2、贴壁型原代细胞
1)原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，虽然被分散成单个细胞，但它们之间的互相影响还是存在的，而且这种影响对细胞能否存活是非常重要的。在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，虽然营养物质很充足，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。
2）原代培养时初始培养在组织分散和分离细胞时细胞可能会受到严重的损伤。适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。
3）由于细胞之间的相互的内在联系被打破，分离细胞在体外培养时经历的生存环境改变很大，在体外存活和生长的难度相应增加。对于贴壁依赖性细胞来说，尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，由于细胞悬液中带有少量培养液，细胞即可以维持存活，又可以很快接触到培养瓶底壁，是细胞迅速黏附于底物，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

3、悬浮型原代细胞
1）进行悬浮细胞培养时必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以5ml为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。
2）能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。

二、分离后-传代前注意事项

1、在原代培养的1天到2天内，要特别注意观察是否有细菌、真菌的污染，一旦发现，要及时清除，防止造成其它细胞的交叉感染；
2、在细胞培养的过程中，要注意培养液颜色的变化，并根据培养液的颜色来决定换液时间。正常情况下，培养液呈桃红色；当培养液呈橙黄色时，细胞一般生长情况良好；呈淡黄色时，可能培养时间较长，营养不足，死亡细胞较多。所以，应在培养液略黄时吸出部分旧培养液，然后补加同等数量的新鲜培养液。换液过程中，不要吸出细胞，不要使培养液溢出培养瓶，避免各种微生物的污染。换液时，应将培养液事先预温至37℃。
一般培养一天，组织细胞即可在培养瓶皿底壁黏附并贴壁生长。2天到3天后，细胞恢复增殖活动。随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，消耗的营养物越来越多，需要换液的时间越来越短。

三、传代注意事项

1、离体培养的细胞生命力比较脆弱，因此传代时细胞没有生长到培养瓶底壁面积的80%以前，不要急于传代。
2、首次传代，由于原代培养中各种类型的细胞常混杂生长，传代时不同细胞又不同的消化时间，因而要根据需要注意及时处理。
3、对贴壁细胞消化后的吹打过程要有序进行，吹打时动作不宜过猛，否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。
4、首次传代时适当增大接种的细胞密度，使培养的细胞间尽快发生相互作用，有利于传代细胞的存活。
5、传代对细胞的影响或伤害程度仅次于将活细胞从生物体内取出并进行原代培养的程度。只是因为传代后的细胞生长并不像刚开始原代培养时那样缓慢罢了。
6、尽可能减少传代次数。每经过一次传代，细胞的生长环境就相应发生一次较大变化。体外生长的细胞若处于动荡的生活环境中，细胞的遗传特性往往容易发生改变。经过多次传代培养的细胞，往往容易转化为恶性细胞