蛋白质提取与纯化技巧——美迪西生物医药

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蛋白质的纯化对于蛋白质的鉴定，功能，结构及相互作用的研究是至关重要的。蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法，是当代生物产业当中的核心技术。

蛋白质的纯化方法主要是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质，再根据蛋白质的差异性将目的蛋白分离出来。蛋白质的分离纯化根据蛋白质本身的性质可以分为多种方法。

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子程度上认识生命景象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具备生物活性的目标物质。蛋白质的制备工作触及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混杂物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分别的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混杂物置于单一物相中，经过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分别目标，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的运用中必须留意保留生物大分子的完好性，避免酸、硷、高温，强烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备通常分为以下四个阶段：选择材料和预解决，细胞的破碎及细胞器的分别，提取和纯化，浓细、单和谐保留。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目标来判别。对于微生物，应留意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，能够获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：

（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；

（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并留意植物品种和生长发育情况不同，其中所含生物大分子的量变革很大，另外与季节性关系亲密。对动物组织，必须选择有效成份含量丰盛的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等解决。另外，对预解决好的材料，若不立刻进行实验，应冷冻保留，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

蛋白质的分离纯化

一、蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类联结的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采取不同溶剂提取分别和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质巩固性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1—5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点思索提取蛋白质和酶时通常采取低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以进程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重议论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值蛋白质，酶是具备等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH领域内。用稀酸或稀碱提取时，应避免过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变革，从而导致蛋白质构象的不可逆变革，通常来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度

稀浓度可增进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分联结，具备保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，通常以0。15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采取0。02—0。05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质联结比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质联结紧密的蛋白质和酶特别优胜，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度领域内（度为10％，40度为6。6％）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择领域较广，也适用于动植物及微生物材料。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

（一）依据蛋白质溶解度不同的分别方法

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显然影响，通常在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增长，此称盐溶；当盐浓度延续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种景象称盐析，将大批盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并积淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。因为各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混杂蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段积淀。

影响盐析的因素有：

（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，通常可在室温中进行。通常温度低蛋白质溶介度下降。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。

（2）PH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。

（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分别的蛋白质经常搀和着其余蛋白质地一起积淀出来（共沉景象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5—3.0％。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中运用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4。1M，即767克／升；0度时饱和溶解度为3。9M，即676克／升），在这一溶解度领域内，许多蛋白质和酶都能够盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其余盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4。5—5。5之间，当用其余pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

蛋白质在用盐析积淀分别后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的改换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G—25或G—50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点积淀法

蛋白质在静电情况时颗粒之间的静电斥力最小，因此溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之积淀，但此法很少独自使用，可与盐析法联结用。

3、低温有机溶剂积淀法

用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度下降并析出，此法辨别力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）依据蛋白质分子大小的差别的分别方法

1、透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其余小的溶质分子经过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法

也称分子排阻层析或分子筛层析，这是依据分子大小分别蛋白质混杂物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadexged）和琼脂糖凝胶（agarosegel）。

（三）依据蛋白质带电性质进行分别蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐步增长的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，达到各自等电点的pH位置就停滞，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法

离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM—纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素），当被分别的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。

（四）依据配体神奇性的分别方法—亲和色谱法亲和层析法（aflinitychromatography）是分别蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步解决即可使某种待提纯的蛋白质从很庞杂的蛋白质混杂物中分别出来，而且纯度很高。这种方法是依据某些蛋白质与另一种称为配体（Ligand）的分子能神奇而非共价地联结。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以庞杂的混杂物情势存在，每品种型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分别（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的独自或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从庞杂的混杂蛋白质中提取出来，因此经常采取几种方法联结使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1／3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波解决法：用一定功率的超声波解决细胞悬液，使细胞急剧震动破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50—100毫克菌体／毫升浓度，在1KG至10KG频率下解决10—15分钟，此法的缺陷是在解决进程会产生大批的热，应采取相应降温办法。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在—20度以下冰冻，室温融解，反复几次，因为细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学解决法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采取十二烷基磺酸钠（SDS）、脱氧胆酸钠等细胞膜损坏，细菌细胞壁较厚，可采取溶菌酶解决效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物品质的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）能够抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸能够抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能消除蛋白水解酥生机，但不是全体，还可经过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适宜于目标物质的提取。

浓缩、单调及保留

一、样品的浓缩

生物大分子在制备进程中因为过柱纯化而样品变得很稀，为了保留和鉴定的目标，经常需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

1、减压加温蒸发浓缩

经过下降液面压力使液体沸点下降，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

2、空气流动蒸发浓缩

空气的流动可使液体加速蒸发，铺成薄层的溶液，外表不断经过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目标，此法浓缩速度慢，不适于大批溶液的浓缩。

3、冰冻法

生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，此后迟缓地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目标。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。

4、吸收法

经过吸收剂直接受除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要改换新的直至达到所需要的体积。

5、超滤法

超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）经过膜时，溶剂和小分子透过，大分子碰壁保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具备成本低，操作便捷，条件柔和，能较好地维持生物大分子的活性，回收率高等优点。运用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须依据工作需要来选用。另外，超滤装置情势，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。此后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，因为透析面积增大，因此使透析时间缩短10倍。

二、单调

生物大分子制备得到产品，为避免变质，易于保留，常需要单调解决，最常用的方法是冷冻单和谐真空单调。真空单调适用于不耐高温，易于氧化物质的单和谐保留，全部装置包括单调器、冷凝器及真空单调原理外，同时增长了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时通常先将待单调的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，此后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具备蓬松、溶解度好、维持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的单调保留。

三、贮存

生物大分子的巩固性与保留方法的很大关系。单调的制品通常比较巩固，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无显然变革，贮藏恳求容易，只需将单调的样品置于单调器内（内装有单调解）密封，维持0—4度冰箱即可，液态贮藏时应留意以下几点。

1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度能力封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。

2、通常需加入防腐剂和巩固剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的巩固剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其巩固性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子通常保留在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。

3、贮藏温度恳求低，大多数在0度左右冰箱保留，有的则恳求更低，应视不同物质而定。

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