酵母双杂交技术原理、试验流程、特点以及应用

为什么研究蛋白质互作？

在生命活动中，DNA的复制与转录、RNA的剪接、蛋白质的翻译与分泌，以及细胞周期调控、信号传导和诸多代谢过程，都是各种相关蛋白质有机相互作用的结果。细胞或组织中的蛋白质并非杂乱无章的混合物——蛋白质间的相互作用与相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。

随着分子生物学实验技术的飞速发展，近十年来涌现出多种研究蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）的方法，其中以Fields和Song创立的酵母双杂交技术为最佳。该方法利用酵母生长速度快且容易操作的特点，在其体系中研究哺乳动物细胞的蛋白-蛋白间的相互作用，通过筛选cDNA文库，高效发现与目标蛋白相互作用的新蛋白。

酵母双杂交技术原理

酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域（domain）组成的。

例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域（DNA binding domain, BD），C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域（transcription activation domain, AD）。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

酵母双杂交试验流程

酵母双杂交技术的优缺点

优点:蛋白质-蛋白质相互作用是细胞生命活动和生物学功能的重要基础。酵母双杂交技术的建立，为研究蛋白质相互作用提供了有效的技术手段，可用于筛选未知相互作用蛋白、鉴定蛋白质互作网络以及研究蛋白质功能。

缺点:尽管酵母双杂交技术已被证实是一种研究蛋白质相互作用的有效方法，但仍存在一定的局限性。

1、该技术并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。

2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。

3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。

酵母双杂交实验注意事项

深入理解酵母双杂交技术的基本原理和筛选方法，是顺利开展实验的前提；成功构建诱饵质粒并做好充分的实验材料准备，则是实验顺利实施的重要基础。只有充分理解酵母双杂交技术的原理，才能合理设计实验流程，有目的地准备实验材料，并对实验结果进行正确分析和判断。尤其应明确不同选择性培养基（或选择压力培养基）的作用及适用条件。

酵母双杂交实验通常需要准备较多的实验材料，且实验周期相对较长，这是其区别于其他蛋白质相互作用研究方法的重要特点，但具体操作并不复杂。

此外，一个阳性克隆的编号通常需要在实验过程中多次记录，因此应始终保持编号的一致性和准确性，避免因记录错误造成结果混淆。

若购买商业化酵母cDNA文库进行筛选，应注意不同厂家的产品类型、载体系统及操作流程可能存在差异，且产品版本会不断更新，因此应仔细阅读产品说明书和实验操作手册，严格按照相应要求开展实验，以避免因操作不当影响筛选结果。

酵母双杂交技术的主要应用

酵母双杂交技术是研究蛋白质相互作用的重要方法之一，在蛋白质组学和分子生物学研究中得到广泛应用，其主要应用包括：

随着分子生物学技术和蛋白质组学研究的不断发展，酵母双杂交技术将与免疫共沉淀（Co-IP）、双分子荧光互补（BiFC）、亲和纯化-质谱（AP-MS）等技术相结合，在蛋白功能解析、信号通路研究及药物靶点发现等领域持续发挥重要作用。

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