美迪西荧光原位杂交技术

    荧光原位杂交可用来检测细胞内特定的DNA或RNA，从而判断特定基因的表达和定位，也可用来检测肿瘤或其他疾病发生或进行中的染色体的改变。

FISH（Fluoresence In Situ Hybridization）技术是80年代开始发展起来的一种新的定位技术。在人类基因组研究中得到了广泛的应用．通过中期染色体的FISH可以进行SCP，Cosmid和YAC的染色体定位，嵌合克隆的鉴别，通过间期核的FISH可以在50kb的分辨率下进行基因作图，最新的研究进展已可以进行伸展的染色质丝(chromatin fibre)的FISH，直接测量基因的长度、从而达到高精度基因作图的目的。随着FISH技术发展，它将在人类以及其它物种基因组研究中发挥更大的作用。

荧光标记的染色体原位杂交技术提供了一种快速而有效的手段，将DNA片段和特定的真核生物细胞的染色体区带联系了起来，并将这些DNA片段排序，这是研究DNA顺序在染色体上位置的最直接的方法。

探针标记时可采用两种基本方式：

（1）直接标记法：将荧光分子直接标记于探针DNA／RNA上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测。这种方式快速简捷，由于杂交信号较弱、且不能进一步放大，以前这种方法用得不多，但它有背景少的优点，近来在一些公司的试剂盒中得到应用。

（2）间接标记法：常用的间接法是将一些类似于半抗原(hapten)的标记分子掺入探针分子中。用的较多的试剂有生物素，地谷新(digoxigenin)，二硝基苯(dinitrophenyl，DNP)，氨基乙酰茐(aminoacetylfuorene，AAF)，汞和磺酸盐(sulfonate)。就掺入方式来说，生物素，地谷新等是以核苷酸衍生物的形式掺入的，可用切口平移法来进行。现在更多的人开始用随机引物法。用这两种方法标记好的探针大小在200一500bp范围内，是用于杂交的最佳大小。另外，也可以在已知顺序的两个引物之间用PCR法来扩增，或从合适的载体上通过RNA转录而来。

1、原理

FISH技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本待测核酸进行定量、定性及定位分析。

2、实验流程

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。

3、特点

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，具有以下优点:

首先，从探针的制备杂交来看，生物素和其他标记分子没有放射性，标记过程和杂交过程没有污染的危险，比较安全。而且用生物素或其他的标记分子标记好以后的探针分子相当稳定，没有半衰期的限制，可以长期保存。荧光显色时间短，不象同位素杂交那样要求长时间曝光，背景简单。灵敏度也毫不逊色。

另外，FISH可以用多种颜色同时显色，这是同位素杂交不可比拟的。这种多色作图，可以便染色体分带和探针信号显不同的颜色而同时观察；也可以用不同荧光标记不同的探针，以确定探针在染色体上酌相对位置。

缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

4、应用

该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。

I．染色体结构变异与非整倍体的检测:荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。利用原位杂交可比较容易地检测出缺失、 附加或替换的染色体。

II．基因扩增和缺失的测:FISH空间分辨率和敏感性使得亲本和扩增基因在抗病虫害细胞中定位成为可能。同时用FISH可定位转基因植物中外源基因位置和拷贝数,此法在番茄、烟草、大麦、小麦、黑麦等作物中已获成功。利用 FISH 技术也 可检测一些与遗传性疾病相关的基因缺失 ,如成功检测了 aniridia 疾病(一种虹膜缺失的罕见遗传异常疾病)患者的缺失基因。

III．FISH 技术为着丝粒结构研究提供了重要手段。同时应用 FISH 技术可直接观察染色体端粒 ,这简化了染色体在核内的结构和功能研究。

IV．基因作图:用 FISH 技术可直接检测 DNA 在染色体上的位置 ,所确定位置是基因在染色体上实际的物理位置。由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响,FISH 技术已成为重复序列和多基因家族作图的重要手段。

V．染色体RNA和基因组进化研究:染色体的主要成分包括DNA和组蛋白,除此之外，还有非组蛋白和RNA。对这些物质在染色体中分布进行精确定位是研究染色体高级结构和构建染色体模型的关键所在。FISH 技术为上述研究提供了有效手段。

荧光原位杂交技术主要应用于以下领域：

细胞的转录谱分析

·体内外 RNAi 传递和基因敲除

·生物标记物研究

·报告基因筛选

·分子病理学

·干细胞分化

·细胞生物学

·神经生物学

随着标记手段、检测试剂以及荧光观察等技术的发展，染色体FISH的应用范围在不断拓宽，激光共执聚焦显微技术的发展，使得核的三维重建可以在计算机的辅助下得以实现。染色体FISH不仅可用来定位基因，而且可用以研究基因在间核中的位置。

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