裸鼠成瘤实验

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裸鼠服务流程

    1、操作方案设计
2、方法开发
3、细胞制备
4、裸鼠成瘤

裸鼠皮下成瘤动物实验方法 

分组:SW620细胞组、SW620转染无关siRNA组、SW620转染目的基因（每组6只）。 
细胞准备及注射裸鼠方法： 到动物室准备实验。 

取出未作处理的小鼠和处理后小鼠用鼠笼，顺序摆放在超净台中。选体形较大的小鼠称重，以3μl/g剂量，腹腔注射10％水合氯醛麻醉小鼠。约5分钟，小鼠开始进入安静状态，将其仰卧固定。切忌麻醉剂过量使用。 

(1)铺白布于鼠板上，仰卧位固定小鼠四爪，碘伏棉球消毒腹侧面上至颈部、下至腹股沟、后至腋后线。消毒两次。铺手术巾于小鼠上，在其左侧剪口（4*4cm），暴露其左侧腹部, 用碘伏消毒一次。在左侧肋弓下缘1cm处向下剪开2cm皮肤，暴露腹壁肌肉，镊子牵拉腹壁肌肉，避开腹腔内脾脏，剪开腹壁肌肉，暴露内脏。用棉签蘸PBS，拨出脾脏下极，切忌牵拉，以免损伤脾脏和胰腺。 
(2)找到脾脏同时，用25微升Matrigel混合于细胞管中，打悬细胞沉淀，使细胞分散均匀成单细胞悬液。用BD针吸净EP管中的单细胞悬液，稍退针芯，打出气泡，在脾脏下极内侧（凹面）进针向脾门方向约2mm开始注射细胞，注射完毕停留约30秒钟，缓慢退出针，以防细胞渗出。同时用蘸PBS的棉球压迫周围出血点止血。 
(3)用注射器吸取庆大霉素注射液（用生理盐水250：1稀释）约400微升，注入腹腔，棉球蘸干皮缘渗出的抗生素。开始缝合腹壁肌肉（连续缝合4针）。再次用注射器吸取庆大霉素注射液约400微升冲洗缝合口，棉球蘸干。缝合皮肤（间断缝合4针）。碘伏棉球消毒缝合口。撤除固定，使小鼠处于自然体位，放于鼠笼中。 
(4)所有细胞注射完毕，剪耳标记，记录剪耳标记及分组情况。 
Day5-7：注意小鼠的状态，及时发现小鼠是否有因手术刺激、胰腺损伤、感染等死亡的情况。 
Day42：颈椎离断，处死小鼠，解剖尸体，观察脾脏肿瘤生长状况，肝脏、肺脏及其他器官是否有转移瘤形成。所有可疑组织均做好标记，拍照，若有表面结节，计数后，冻于液氮中。视结果情况用10%甲醛溶液固定过夜后做病理。 

裸鼠皮下成瘤实验技巧

1、细胞状态是成瘤实验的关键，所以细胞生长状态一定要好，取处于对数生长期的细胞，细胞达80-90%左右密度为宜;收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。
2、胰酶消化细胞后用预冷的PBS洗两遍，目的为去除细胞中的血清。
3、用PBS或者无血清培养基吹打细胞沉淀至合适的浓度，一般皮下瘤接种的细胞量为1-5×10^6个细胞/支，接种体积为0.1ml，因此细胞悬液的浓度为1-5×10^7个细胞/ml。
4、细胞消化后应尽快接种到裸鼠皮下，一般尽量在半小时内完成，途中将细胞悬液放在冰上降低细胞的代谢。
5、选择的裸鼠一般在5-8周龄，体重18-20g左右，种植部位选择血供丰富区域，如腋窝中后部、腹股沟中上部。
6、接种前用枪将细胞悬液充分的吹散，防止细胞成团而降低细胞成活率。
7、接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，减少注射后细胞悬液从针眼溢出。
8、如何抓牢裸鼠?左手拇指和食指捏紧裸鼠颈背部皮肤，小拇指夹住裸鼠尾巴。

9、接种后一周左右可以见到皮下开始出现肿块。
10、根据肿瘤细胞的特性和接种细胞的量，一般皮下成瘤的周期为1-2个月。肿瘤不宜生长过大，一般不要超过1000mm3 ，肿瘤负荷过大常常会以违背动物伦理而被杂志社刁难(因为这个问题悲惨地被plos one拒过稿）。
11、肿瘤大小测量一般为1周两次，游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位。V=1/2*a*b2 (a为长轴，b为短轴)。
12、皮下瘤取下后一部分冻液氮用作以后提蛋白和RNA，一部分福尔马林固定用做免疫组化、免疫荧光等。

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